动物源性食品蜂蜜中六种氟喹诺酮药物残留检测方法研究 85页

中图分类号：R917单位代码：10660UDC：615.2学号：10660S120136学科专业代码：100704〃密级：公开贵阳医学院2015届硕士学位论文(科学学位）动物源性食品蜂蜜中六种氟喹诺酮药物残留检测方法研究Studyondetectionmethodsofsixkindsofanimaloriginfluoroquinoloneresiduesinhoneyproduct研究生：杨微微导师：郝小燕教授许乾丽主任药师年级2012级专业：药物分析二〇一五年五月 责阳医学院学位论文原创炷声明本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。除与外单位合作项目将予以明确方式规定外，本研究已发表与未发表成果的知识产权均归属贵阳医学院。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。作者签名（手写）：mm"导师签名（手写）：^16~年々月u日^^年r月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权贵阳医学院可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于（请在以下相应方框内打“V”）：1、保密□,在_年解密后适用本授权书。2、不保密作者签名（手写）：导师签名（手写）：_薄乞瓦>〇_年s月V日年产月茨5曰 中图分类号：R917单位代码：10660UDC：615.2学号：10660S120136学科专业代码：100704密级：公开2015届硕士学位论文（科学学位）动物源性食品蜂蜜中六种氟喹诺酮药物残留检测方法研究Studyondetectionmethodsofsixkindsofanimaloriginfluoroquinoloneresiduesinhoneyproduct论文作者：杨微微指导教师：许乾丽主任药师申请学位：医学硕士培养单位：药学院学科专业：药物分析研究方向：药品质量控制关键技术研究药品检验研究起止日期：2013年9月至2014年12月论文评阅人：盲评答辩委员会主席：刘建华研究员论文答辩日期：2015年5月21日二〇一五年五月 动物源性食品蜂蜜中六种氟喹诺酮药物残留检测方法研究专业：药物分析硕士研究生：杨微微导师：郝小燕；许乾丽【摘要】目的：建立简便、快速、重现性好检测蜂蜜中诺氟沙星、环丙沙星、单诺沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、双氟沙星6种氟喹诺酮残留量的方法。方法：1.采用薄层色谱法（TLC）对蜂蜜中可能残留的上述六种氟喹诺酮进行检测方法的研究。样品经含5%乙酸的乙腈涡旋提取，离心取上清液，采用改进的分散固相萃取（QuEChERS）技术净化后作为供试品溶液，三氯甲烷-甲醇-乙酸乙酯-氨水-水（1510421∶∶∶∶）下层溶液为展开剂展开，取出，晾干，喷以显色剂3%三氯化铽；2.采用高效液相色谱-荧光检测器（HPLC-FLD）对蜂蜜中可能残留的上述六种氟喹诺酮残留进行定量检测方法的研究。样品经前处理得到供试品溶液，UltimateXB-C18（250×4.6mm，5µm）色谱柱，柱温：30℃，以乙腈∶0.2%甲酸水（13∶87）为流动相，流速：1.0mL/min，荧光检测器，激发波长280nm发射波长450nm；3.用超高效液相色谱结合质谱（UPLC-MS/MS）对蜂蜜中可能残留的上述六种氟喹诺酮残留进行检测方法的研究。供试品溶液依次经UPLC-MS/MS分析测定，色谱柱：AgilentZORBAXSB-C18（2.1mm×50mm，1.8µm），流动相A：乙腈，B：含0.1%甲酸的甲酸铵溶液，流速：0.5mL/min，采用梯度洗脱方式，柱温：45℃；进样量：2µL，ESI离子源，毛细管电压∶3000-3500kV，干燥气温度：300℃，干燥气流量：5mL/min，雾化气压力：50psi，载气：N2。结果：1.薄层色谱法在紫外365nm波长下检视，诺氟沙星、环丙沙星、单诺沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、双氟沙星6斑点分离较好，Rf值0.2-0.8；2.高效液相色谱法测定结果显示6种氟喹诺酮分离度较好，在0.02～0.5µg/mL浓度范围内具有良好的线性关系（r=0.9999），检出限为0.97～3.91µg/kg，平均加标回收率为72.08%～109.83%。相对标准偏差（RSD）1.59%～12.16%；3.高效液相色谱结合质谱法测定结果显示6种氟喹诺酮2～100ng/mL浓度范围内呈良好的线性关系（r=0.9968）。平均加标回收率93.36%～129.75%，相对标准偏差（RSD）2.15%～12.23%。结论：实验建立的TLC方法简单快速，适用于基层单位对蜂蜜中氟喹诺酮类残留的初筛；HPLC-FLD方法检出限低，适用于检测机构大规模抽检；UPLC-MS/MS方法灵敏度高，可用于阳性样品的确证。【关键词】蜂蜜；氟喹诺酮；薄层色谱；高效液相色谱；质谱；II StudyondetectionmethodsofsixkindsofanimaloriginfluoroquinoloneresiduesinhoneyproductMajor:PharmaceuticalanalysisPostgraduate:YangWei-WeiSupervisor:HaoXiaoYanXuQianLI[Abstract]Objective:Toestablishamethodfordeterminingsixkindsoffluoroquinolonesnorfloxacin,ciprofloxacin,danofloxacin,enrofloxacin,sarafioxacin,anddifloxacininhoney.Methods:1.Thedetectionmethodofsixkindsoffluoroquinoloneresiduesaboveinhoneyproducthasbeenresearchedbyusingthinlayerchromatography(TLC).Vortexextractthesamplebythesolutionof5%aceticacidinacetonitrile,centrifugalextractthesupernatantandpurifywithdispersive-solidphaseextraction(QuEChERS).Usingthelowersolutionoftrichloromethane-methylalcohol-ethylacetate-ammonia-water(15∶10∶4∶2∶1)asasolventtoextractanddry,andbesprainedwithchromogenicagent3%Terbium(III)chloridehexahydrate.2.Weusehighperformanceliquidchromatographywithfluorescence(HPLC-FLD)tostudythedetectionmethodofsixfluoroquinoloneresiduesinhoneyproducts.Solutionsareobtainedbypretreatmentofsamples.WeusetheUltimateXB-C18(250×4.6mm,5µm)chromatographiccolumn,withisocraticelutionusingacetonitrileand0.2%formicacidsolution(13∶87)asmobilephaseataflowrateof1.0mL/min.Thecolumntemperatureis30℃.Highperformanceliquidchromatography-fluorescencedetection,excitationwavelength280nm,emissionwavelength450nm.3.Weusedultraperformanceliquidchromatographycombinedwithmassspectrometry(UPLC/MS/MS)tostudythequalitativemethodsofsixfluoroquinolonesthatresidueinhoneyproducts.SamplesolutionwastestedinsequencebyUPLC/MS/MSanalysis,chromatographiccolumn,agilentZORBAXSB-C18(2.1mm×50mm,1.8µm).TheacetonitrileasthemobilephaseA,ammoniumformatesolutionwith0.1%methanoicacidforBusingthegradientelutionmodewithcolumnflowrate0.5mL/min.Temperature45℃.Injectionvolume2µL,ESIasionizationsource,Capillaryvoltage3000-3500kV.Temperatureofdryinggas,300℃.III Gasflowingrate5mL/min,atomizingairpressure50psi.Results:1.Thebetterseparatingdegreefornorfloxacin,ciprofloxacin,danofloxacin,enrofloxacin,sarafioxacinanddifloxacinwereobtainedundertheUV365nmbyusingthinlayerchromatography(TLC)withRfrangedfrom0.2to0.8.2.Theresultsofhighperformanceliquidchromatographydeterminationshowedthatsixfluoroquinolone’sseparatingdegreeisclearandagoodlinearrelationshipwasobtainedintherangeof0.02to0.5µg/mL,r=0.9999,thedetectionlimitrangedfrom0.97to3.91µg/kg.Theaveragerecoveryratewasbetween72.08%and109.83.%.Therelativestandarddeviation(RSD)rangedfrom1.59%to12.16%.3.Ultraperformanceliquidchromatographycombinedwithmassspectrometry(UPLC/MS/MS)determinationresultsshowedthatsixkindsoffluoroquinoloneshadagoodlinearrelationshipintherangeof2.00to100ng/mLr=0.9968.Theaveragerecoveryratewasbetween93.36%and129.75%whiletherelativestandarddeviation(RSD)rangedfrom2.15%to12.23%.Conclusion:ThemethodofTLCisappliedtoprimaryscreeningtestoffluoroquinolonessinthehoneyduetoitssimpleoperationandapplicationinbasicunit.HPLC-FLDissuitableforlargescaledetectionforinstitutionbecauseoflowdetection.Duetohighsensitivity,UPLC-MS/MScanbeusedforconfirmationanalysisofpositivesamples.[KeyWords]honey,fluoroquinolones,detectionmethod,TLC,HPLC,MSIV 目录原创性声明和版权使用授权书..........................................................Ⅰ中文摘要...............................................................................................Ⅱ英文摘要...............................................................................................Ⅲ目录.......................................................................................................Ⅴ略缩词表.............................................................................................VIII引言.......................................................................................................01第一章蜂蜜中6种氟喹诺酮类药物残留薄层色谱检测方法研究041材料与方法........................................................................................041.1材料.................................................................................................041.2方法.................................................................................................061.3耐用性考察....................................................................................091.4方法检出限....................................................................................122结果....................................................................................................133讨论....................................................................................................133.1净化剂考察....................................................................................133.2展开剂考察....................................................................................153.3显色剂考察....................................................................................154结论....................................................................................................17第二章蜂蜜中6种氟喹诺酮类药物残留高效液相检测方法研究191材料与方法........................................................................................19V 1.1材料.................................................................................................191.2方法.................................................................................................191.3系统适应性实验............................................................................211.4方法学考察....................................................................................222结果....................................................................................................293讨论....................................................................................................303.1样品前处理方法考察....................................................................303.2色谱条件考察..............................................................................344结论....................................................................................................35第三章蜂蜜中6种氟喹诺酮类药物残留液质联用检测方法研究371材料与方法........................................................................................371.1材料.................................................................................................371.2方法.................................................................................................371.3系统适应性实验............................................................................401.4方法学考察....................................................................................412结果....................................................................................................483讨论....................................................................................................513.1色谱条件考察................................................................................513.2质谱条件碎裂电压的考察............................................................513.36种氟喹诺酮质谱裂解规律的探析.............................................524结论....................................................................................................57结语.....................................................................................................59VI 参考文献...............................................................................................60综述.......................................................................................................63参考文献...............................................................................................70作者简历...............................................................................................73致谢.......................................................................................................74学位论文数据集..................................................................................75VII 英文缩略词表英文缩写英文全称中文全称FLDFluorescenceDetector荧光检测器FQsFluoroquinolone氟喹诺酮FDAFoodandDrugAdministration食品药品监督管理局HPLCHighPerformanceLiquidChromatography高效液相色谱二乙烯苯-N-乙烯基HLBDivinylbenzeneandN-vinylpyrrolidone吡咯烷酮MSMassSpectrum质谱PSAN,N"-Di-n-propylethylenediamineN-丙基乙二胺PAXCationexchangepolymer阳离子交换聚合物SPEPolystyrene-divinylbenzene聚苯乙烯-二乙烯基苯TLCThinlayerchromatography薄层色谱UPLCUltraPerformanceLiquidChromatography超高效液相色谱VIII 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文0引言1选题背景食品药品安全问题不仅关系到人类的身体健康和生命安全，更直接影响着社会的稳定和经济的发展，已然成为世界瞩目的焦点。改革开放以来，我国对于食[1-3]品药品安全的建设从未间断过，投入力度亦是逐年递增。国家的重视，人民群众的关心使得食品药品行业得到快速发展，食品药品工业现代化程度日趋提高。随着我国生活水平的提高，动物源性食品在膳食中的比重不断增加，其质量安全问题更是受到各国政府和人民的关注，而兽药残留是导致动物源性食品安全性下降的重要因素之一。药物残留不仅危害人类健康，也严重影响了畜牧业的持续健康发展。加入世贸组织后，我国畜产品不断遭遇技术性的贸易壁垒，产品形[5-7]象严重受损，在国际贸易中处于劣势。因此，兽药残留分析成为亟待解决的重要课题必须制定严格的药残评价体系，严格控制产品的药物残留，提高产品质量，从而保障人类健康安全，有效保障畜牧养殖业的可持续发展。2选题目的中国是蜂蜜生产和出口大国，蜂蜜年出口量占全球蜂蜜年出口总量的20%左右。欧盟是世界上重要的蜂蜜进口地区，2009年其进口蜂蜜量占世界蜂蜜总进口量的31%，居世界第一。但受2002年氯霉素残留、2008年红霉素等抗生素超标事件的影响，导致欧盟在我国的蜂蜜进口量大幅下降。因此建立全面有效的[8-14]抗生素监管体系对于我国蜂蜜贸易迫在眉睫。FQs（Fluoroquinolone，氟喹诺酮）系化学合成药物，因价格低廉、抗菌谱广、抗菌活性强在医学特别是在兽医学中取得广泛应用，由于致病菌产生的耐药性和某些FQs的潜在致癌性质，其[15-20]残留问题已引起广泛关注。许多国家纷纷制定出喹诺酮在动物性食品中的限量。美国食品药品监督管理局规定了家禽肉中的部分FQs的限量；欧盟在1999年3月公布的NO508/1999号法规中对牛奶中的单诺沙星、氟甲喹、马波沙星、恩诺沙星和环丙沙星的最高残留限量作了规定。我国农业部《动物性食品中兽药最高残留限量》235号公告中规定了不同动物源性食品靶组织（肉、蛋和奶等）中的最高残留限量：恩诺沙星（100-300μg/kg）；沙拉沙星（10-80μg/kg）；二氟沙星（100-1900μg/kg）；达氟沙星（30-400μg/kg）；单诺沙星（50-400μg/kg）；恶硅酸（50-150μg/kg）；氟甲喹（50-3000μg/kg）；但对其他氟喹诺酮类药物残1 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文[21-26]留未做最高残留限量规定。2011年4月20日，卫生部发布了《食品安全标准蜂蜜》（GB/T14963-2011），该标准为我国唯一的蜂蜜国家标准，规定农药残留限量应符合国家标准GB/T2763，兽药残留量应符合相关标准的规定。蜂蜜中氟喹诺酮类残留的检测我国目前采用方法为GB/T23412-2009《蜂蜜中19种喹诺酮类药物残留的测定》中规定检测方法为液相色谱-串联质谱法，检出限1μg/kg与欧盟、美国和日本等国目前采用的方法检出限基本相同。目前研究报道有关蜂蜜中抗生素残留主要有微生物法、酶联免疫法、薄层色谱法、毛细管电泳法、高效液相色谱法、液相色谱质谱联用法等检测方法。其中最常用的方法是高效液相[27-37]色谱法，分别使用紫外、荧光、紫外检测器来检测。可是由于动物源性食品中氟喹诺酮类药物残留的微量性，对检测器的灵敏度要求较高，而高灵敏度、高选择性的质谱检测器又受条件的限制，在目前技术和经济条件下难以向社会推广。所以建立高通量、高灵敏度、高选择性、简便、经济的快速筛查及含量测定方法是亟待解决的难题。针对当前氟喹诺酮类药物残留检测技术上存在诸多问题，本项目选取畜牧养殖业产品中的重要品种蜂蜜，通过比较FQs类药物残留筛查和检测技术：薄层色谱检测技术、高效液相色谱荧光检测、液质联用技术，综合几种方法的优缺点，建立高通量的筛查方法，建立高灵敏度、高选择性、多成分同时分析的FQs残留定量及确认方法。3选题意义随着我国与国际的接轨，尤其是在加入世界贸易组织以后，我国对进出口食品药品的质量要求越来越高。屡屡曝光关于食品药品的新闻，对我国的贸易形象造成了很大的负面影响，对此国家食品药品安全监督管理部门不断加强对食品药品的监督管理，优化检测分析方法及提升标准并加以实施。近年来世界各国对有害残留物质种类及最大残留量在食品药品中的控制要求越来越严格，我国的食品药品安全性质量控制已面临与时俱进的严重挑战。所以，不断研究及建立食品中药物残留量检测分析方法具有重大的现实社会意义。此外，论文针对动物源性食品中氟喹诺酮药物残留进行相关研究，取贵州畜牧养殖业产品中的重要品种蜂蜜，通过实验比较薄层色谱检测技术、高效液相色谱荧光检测、液质联用技术几种检测方法的优缺点，建立①高通量的筛查方法；②高灵敏度、高选择性、多成分同时分析的FQs残留定量及确认检测的方法；2 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文③可满足不同检测机构对蜂蜜中氟喹诺酮类药物残留的检测。对建立动物源性食品蜂蜜中氟喹诺酮（FQs）类药物残留评价体系，形成食品安全监管建议具有奠定基础性的重要意义。4创新点（1）首次采用薄层色谱法对蜂蜜中可能添加的6种氟喹诺酮类药物残留J进行鉴别。（2）采用高效液相色谱法对蜂蜜中可能添加的6种氟喹诺酮类药物残留做定量检测研究。优化前处理方法，减少了繁琐的操作步骤，缩短了检测周期，极大提升了检测效率。优化色谱条件，使6种氟喹诺酮完全分离，降低了样品检出限。（3）首次将分散固相萃取（QuEChERS）（-Quickly，Easy，Cheap，Effective，Rugged，Safe）快速样品前处理技术运用到液相色谱-质谱联用法测定蜂蜜中氟喹诺酮类药物残留的定性定量检测中。3 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文第一章蜂蜜中6种氟喹诺酮类药物残留薄层色谱检测方法研究1材料与方法1.1材料表1-1主要实验仪器Table1-1Themainexperimentalinstruments仪器名称型号生产厂家电子分析天平XS205Mettler-Toledo仪器有限公司恒温水浴锅DK-98-ⅡA天津市泰斯特仪器有限公司涡旋仪TALBOYS美国亨利特里姆有限公司医用离心机TD6M昆山市超声仪器有限公司纯水机Direct-Q3美国密理博公司自动点样仪ATS-4瑞士CAMAG（卡玛）公司电热恒温鼓风干燥箱GZX-GF101-MBS上海跃进医疗器械厂氮吹仪TTL-DCI余姚市长江温度仪表厂1.1.1标准品诺氟沙星、环丙沙星、单诺沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、双氟沙星6种氟喹诺酮标准品见表1-2。表1-26种氟喹诺酮标准品Table1-2thesixfluoroquinolonesstandards化合物英文名批号纯度%生产厂家诺氟沙星NorfloxacinC1564800099.5德国Dr.EhrenstorferGmbH公司环丙沙星CiprofloxacinC1166850095.0德国Dr.EhrenstorferGmbH公司单诺沙星DanofloxacinC1196050094.0德国Dr.EhrenstorferGmbH公司恩诺沙星EnrofloxacinC1317000098.5德国Dr.EhrenstorferGmbH公司沙拉沙星SarafioxacinC1690800095.5德国Dr.EhrenstorferGmbH公司双氟沙星DifloxacinC1262700097.5德国Dr.EhrenstorferGmbH公司1.1.2试剂乙腈（色谱纯美国天地试剂公司）；甲酸（分析纯重庆日东化工有限公司）；4 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文三氯甲烷（分析纯国药集团化学试剂有限公司）；甲醇（分析纯国药集团化学试剂有限公司）；乙酸乙酯（分析纯上海申博化工有限公司）；氨水（分析纯成都市科龙化工试剂厂）；Mcllvaine缓冲液（pH4）：磷酸氢二钠27.6g、柠檬酸12.9g、乙二胺四乙酸二钠37.2g（分析纯重庆日东化工有限公司），用水溶解后稀释并定容至1000mL；N-丙基乙二胺（PSA）（美国SELECTRA公司）；三氯化铕、三氯化铽（Aladdin-阿拉丁试剂上海有限公司）。硅胶G薄层色谱预制板（规格：100×200mm，青岛海洋化工厂分厂），硅胶G（青岛海洋化工有限公司干燥剂生产，批号100277），Merck预制板（规格：100×200mm，德国MerckKGaADarmstadt公司）。1.1.3样品表1-3蜂蜜样品信息Table1-3honeysamples编号名称生产厂家规格生产日期有效期1蜂蜜上海冠生园蜂制品有限公司500g2014030518个月2柠檬蜂蜜浙江金太阳食品有限公司320g2014060324个月3野玫瑰蜂蜜四川杨代蜂蜜园有限公司238g2014060624个月4洋槐蜂蜜滁州建颐源蜂业有限公司200g2014060818个月5杨槐蜂蜜江西新青云蜂业科技有限公司500g2014050618个月6枣花蜂蜜四川杨代蜂蜜园有限公司500g2014041724个月7锻树蜂蜜四川杨代蜂蜜园有限公司560g2013120924个月8枸杞蜂蜜纵阳县高片源蜂业有限公司500g2014051324个月9土黄连蜜淮安甜蜜人生蜂产品有限公司500g2014010624个月10洋槐蜂蜜江西新青云蜂业科技有限公司500g2014020818个月11小富童蜂蜜四川杨代蜂蜜园有限公司320g2014050824个月12欠斯玛洋槐花蜂蜜北京嘉盛行商贸有限公司350g2014060824个月13洋槐蜂蜜江西新青云蜂业科技有限公司500g2014050618个月贵阳市花溪湖潮羊艾食品药品14紫云英蜂蜜1000g2013102024个月加工基地5 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文编号名称生产厂家规格生产日期有效期15欠斯玛洋槐花蜂蜜北京嘉盛行商贸有限公司350g2012011024个月17洋槐蜜马鞍山金田蜂产品有限公司150g2014040324个月18益母草蜜马鞍山金田蜂产品有限公司150g2014040324个月19紫云英蜜马鞍山金田蜂产品有限公司150g2014040324个月20枣花蜜贵州夜郎蜂业有限公司150g2014040324个月21椴树蜜马鞍山金田蜂产品有限公司150g2014040124个月Honey22马鞍山金田蜂产品有限公司40g2012080736个月Banabayarmak22油菜蜂蜜四川杨代蜂蜜园有限公司500g2014050724个月24野桂花蜜马鞍山金田蜂产品有限公司150g2014040324个月25楼恒泰蜂蜜四川杨代蜂蜜园有限公司500g2014072524个月26野菊花蜜四川杨代蜂蜜园有限公司500g2014072618个月27土蜂蜜淮安甜蜜人生蜂产品有限公司500g2014080218个月28洋槐蜂蜜四川杨代蜂蜜园有限公司15g*20条2014051618个月28洋槐蜜淮安甜蜜人生蜂产品有限公司500g2014072618个月30荔枝蜜淮安甜蜜人生蜂产品有限公司500g2014062624个月30洋槐蜂蜜江西新青云蜂业科技有限公司500g2014081418个月1.2方法1.2.1标准使用溶液标准贮备溶液：分别精密称取对照品，诺氟沙星0.01089g，环丙沙星0.01070g，单诺沙星0.01081g，恩诺沙星0.01011g，沙拉沙星0.01027g，双氟沙星0.01022g分别置于10mL容量瓶中，用200μL甲酸溶解后，再用甲醇稀释至刻度，摇匀。中间工作对照品溶液：精密吸取上述溶液1.00mL分别置于100mL容量瓶中，用甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，即得相应浓度分别为10.8356，10.1650，10.1614，9.9584，9.8079，9.9645µg/mL的中间工作对照品溶液。标准使用溶液：精密吸取诺氟沙星、环丙沙星、单诺沙星、恩诺沙星、双氟6 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文沙星标准贮备溶液1.00mL、沙拉沙星标准贮备溶液5.00mL分别置于10mL容量瓶中，用甲溶液稀释至刻度，摇匀，即得相应浓度分别为1.0836，1.0165，1.0161，0.9958，0.9964，4.9039µg/mL的标准使用溶液。1.2.2混合对照标准使用溶液分别精密吸取诺氟沙星、环丙沙星、单诺沙星、恩诺沙星、双氟沙星标准贮备溶液1.00mL、沙拉沙星标准贮备溶液5.00mL至同一100mL容量瓶中，用甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，即得相应浓度分别为1.0836，1.0165，1.0161，0.9958，0.9964，4.9039µg/mL的混合对照标准使用溶液（临用前现配）。1.2.3供试样品溶液称取供试样品10.00g（准确至0.01），置100mL离心管中，加入Mcllvaine缓冲液5mL，涡旋3min，加入含5%乙酸的乙腈溶液至50mL涡旋10min后加入无水硫酸镁5g涡旋2min，离心（5000r/min，5min），吸取上清液至60mm蒸发皿中40℃水浴挥干，加入2mL甲醇溶液溶解，加入无水MgSO4、NaCl、PSA各0.3g涡旋1min离心（5000r/min，5min），取上清液氮吹仪吹至1mL作为待测溶液。1.2.4模拟阳性样品溶液称取供试样品10.00g（准确至0.01g），置100mL离心管中，加入混合标准溶液1mL，加入Mcllvaine缓冲液5mL，涡旋3min，加入含5%乙酸的乙腈溶液至50mL涡旋10min后加入无水硫酸镁5g涡旋2min，离心（5000r/min，5min），吸取上清液至60mm蒸发皿中40℃水浴挥干，加入2mL甲醇溶液溶解，加入无水MgSO4、NaCl、PSA各0.3g涡旋1min离心（5000r/min，5min），取上清液氮吹仪吹至1mL作为待测阳性样品溶液。1.2.5薄层板的制备与活化称取4.00g硅胶G于100mL烧杯中，加入11mL0.3%-0.5%羧甲基纤维钠水溶液，仔细搅拌15min成糊状。然后用玻璃棒小心引流倒在100×200mm干净干燥的玻璃板上，快速左右倾斜，使糊状物均匀地分布在整个玻璃板，厚度为0.3～0.5mm，然后放置晾干后在105～110℃的烘箱里活化30min，即置于有干燥剂的干燥器中备用。1.2.6点样7 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文在同一薄层板上，距板底边13mm处依次点6种氟喹诺酮对照品溶液5μL、混合对照溶液5μL和供试品溶液10μL，将溶液点宽度为3mm带状。1.2.7展开及检视以三氯甲烷-甲醇-乙酸乙酯-氨水-水（15∶10∶4∶2∶1）下层溶液为展开剂，饱和15min后展开，取出，晾干，再喷以3%的三氯化铽乙醇溶液，在105℃烘1min，取出，冷至室温，在紫外365nm波长下检视。诺氟沙星、环丙沙星、单诺沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、双氟沙星6斑点分离良好，Rf值0.2-0.8。如图1-1所示。注：1.诺氟沙星（Norfloxacin）；2.环丙沙星（Ciprofloxacin）；3.单诺沙星（Danofloxacin）；4.恩诺沙星（Enrofloxacin）；5.沙拉沙星（Sarafioxacin）；6.双氟沙星（Difloxacin）；7.混合对照品（Mixedstandards）图1-16种氟喹诺酮展开TLC鉴别图谱Fig.1-1TLCchromatogramsofthesixfluoroquinolones1.2.8专属性在同一薄层板上，距板底边12mm处依次点6种氟喹诺酮混合标准使用溶液、阴性供试品溶液和模拟阳性样品溶液各5μL，将溶液点成带状，带状宽度为3mm。按“1.2.7”项下条件展开及检视，结果表明：阴性样品无干扰。本法专属性强，适用于蜂蜜中6种氟喹诺酮的鉴别。如图1-2所示。8 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文注：1.混合对照品（Mixedstandards）；2.阴性样品（negativesample）；3.阳性样品（Positivesample）图1-2专属性TLC鉴别图谱Fig.1-2TLCchromatogramsofthespecificity1.3耐用性的考察取自制模拟阳性样品溶液和对照品溶液进行不同薄层板、温度和湿度的耐用性考察。1.3.1薄层板的考察取“1.2.1”项下标准使用溶液和“1.2.4”项下模拟样品溶液，按“1.2.6”项下条件点样，按“1.2.7”项下条件分别对国产高效硅胶G预制板（20130806，青岛海洋化工厂分厂）、国产普通硅胶G预制板（20140520，烟台江友硅胶开发有限公司）、硅胶G（0120246，青岛海洋化工有限公司）自制薄层板、Merck板（HC30863956，默克化工技术（上海）有限公司）四种薄层板进行考察。结果表明：四种薄层板中6种氟喹诺酮均能较好，薄层板上供试品与对照品的色谱行为基本一致，斑点清晰，条带无扩散，分离效果最好。其中在Merck板中的分离效果优于其他薄层板，最后选择Merck板进行薄层鉴别。如图1-3所示。9 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文ABCD注：A.Merck板（Merckplate）；B.自制板（homemadeplate）；C.普通硅胶G预制板（OrdinarySilicagelGprefabricatedthinlayerplate）；D.高效硅胶G预制板（efficientSilicagelGprefabricatedthinlayerplate）；1.诺氟沙星（Norfloxacin）；2.环丙沙星（Ciprofloxacin）；3.单诺沙星（Danofloxacin）；4.恩诺沙星（Enrofloxacin）；5.沙拉沙星（Sarafioxacin）；6.双氟沙星（Difloxacin）；7.混合对照品（Mixedstandards）；8.阳性样品（Positivesamples）图1-3不同薄层板考察图谱Fig.1-3chromatogramsofthedifferentthinlayerboard1.3.2温度的考察取“1.2.1”项下标准使用溶液和“1.2.4”项下模拟样品溶液用点样仪，按“1.2.6”项下条件点样，按“1.2.7”项下条件分别在低温（4℃）和高温（40℃）10 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文环境下考察温度对展开效果的影响。结果表明供试品和对照品在高温和低温环境色谱行为一致，各斑点均能实现较好的分离，说明本方法具有良好的温度适应性。如图1-4所示。AB注：A.温度4℃（temperature4℃）B.温度40℃（temperature40℃）1.诺氟沙星（Norfloxacin）；2.环丙沙星（Ciprofloxacin）；3.单诺沙星（Danofloxacin）；4.恩诺沙星（Enrofloxacin）；5.沙拉沙星（Sarafioxacin）；6.双氟沙星（Difloxacin）；7.混合对照品（Mixedstandards）；8.阳性样品（Positivesamples）图1-4温度TLC鉴别图谱Fig.1-4TLCchromatogramsoftemperature1.3.3湿度的考察取“1.2.1”项下标准使用溶液和“1.2.4”项下模拟样品溶液用点样仪，按“1.2.6”项下条件点样，湿度以不同浓度的硫酸溶液进行控制，当硫酸-水（27.5∶100，v/v）时，相对湿度为72%；当硫酸-水（68.0∶100，v/v）时，相对湿度为32%。按“1.2.7”项下条件分别在高湿（72%）和低湿（32%）条件下展开及检视，进行考察。结果表明供试品和对照品在高湿和低湿环境色谱行为一致，各斑点均能实现较好的分离，说明本方法具有良好的湿度适应性。如图1-5所示。11 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文AB注：A.湿度32%（relativehumidity32%）；B.湿度72%（relativehumidity72%）；1.诺氟沙星（Norfloxacin）；2.环丙沙星（Ciprofloxacin）；3.单诺沙星（Danofloxacin）；4.恩诺沙星（Enrofloxacin）；5.沙拉沙星（Sarafioxacin）；6.双氟沙星（Difloxacin）；7.混合对照品（Mixedstandards）；8.阳性样品（Positivesamples）；图1-5湿度TLC鉴别图谱Fig.1-5TLCchromatogramsofrelativehumidity1.4方法检出限按“1.2.4”项下自制含量分别为5、10、20、30、40、50、60、80μg/kg阳性样品溶液，按“1.2.6”项下条件进行点样“1.2.7”项下条件进行展开及检视，以恰好可见斑点为样品检出限。经实验验证结果表明样品检出限为20μg/kg如图1-6所示。注：1.5μg/kg；2.10μg/kg；3.20μg/kg；4.30μg/kg5.40μg/kg；6.50μg/kg；7.60μg/kg；8.80μg/kg图1-6样品检出限TLC鉴别图谱Fig.1-6TLCchromatogramsofsampledetectionlimit12 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文2结果对30批样品进行检测，若供试品的色谱中与对照色谱相应的位置上显相同颜色的斑点，则视为疑似阳性样品。结果表明：4号样品检出为疑似阳性样品，检出组分为诺氟沙星。如图1-7所示。注：1～30蜂蜜样品（honeysamples）；31混合对照品（Mixedstandards）图1-7蜂蜜样品TLC鉴别图谱Fig.1-7TLCchromatogramsofthehoneysamples3讨论3.1净化剂考察目前对于氟喹诺酮类药物残留的净化大多数选择固相萃取。但是此方法操作步骤繁琐、费用较高且回收率普遍偏低。本研究对近年来在农兽药残留应用广泛的样品前处理技术-QuEChERS进行了探索。QuEChERS（Quickly，Easy，Cheap，Effective，Rugged，Safe）包括2个步骤，即提取和净化。提取过程中加入无水[38-40]硫酸镁用以除水，氯化钠使其盐析。净化过程多根据所要除去杂质性质的不同选用不同比例的吸附剂（无水MgSO4和NaCl），目前分散固相萃取技术常用的吸附剂有C18、NH2、PSA、PAX4种，实验选取在氟喹诺酮类药物检测运用较多的PSA作为吸附剂。实验对PSA、无水MgSO4和NaCl的用量进行了考察，如表1-4。实验证明无水MgSO4和NaCl的用量对净化除杂影响较小，净化效果随着PSA用量的加大呈递增趋势，无水MgSO4、NaCl、PSA的用量各为0.3g净化效果最佳。如图1-8所示。13 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文表1-4PSA、无水MgSO4和NaCl用量考察Table1-4TheamountofPSA、MgSO4andNaClC1C2C3B1A1B1C1A1B1C2A1B1C3A1B2A1B2C1A1B2C2A1B2C3B3A1B3C1A1B3C2A1B3C3B1A2B1C1A2B1C2A2B1C3A2B2A2B2C1A2B2C2A2B2C3B3A2B3C1A2B3C2A2B3C3B1A3B1C1A3B1C2A3B1C3A3B2A3B2C1A3B2C2A3B2C3B3A3B3C1A3B3C2A3B3C3注：A1.NaCl0g；A2.NaCl0.1g；A3.NaCl0.3g；B1.无水MgSO40g；B2.无水MgSO40.1g；B3.无水MgSO40.3g；C1.PSA0.0g；C2.PSA0.1g；C3.PSA0.3g；.注：1.A1B1C1；2.A1B2C1；3.A1B3C1；4.A2B1C1；5.A2B2C1；6.A2B3C1；7.A3B1C1；8.A3B2C1；9.A3B3C1；10.A1B1C2；11.A1B2C2；12.A1B3C2；13.A2B1C2；14.A2B2C2；15.A2B3C2；16.A3B1C2；17.A3B2C2；18.A3B3C2；19.A1B1C3；20.A1B2C3；21.A1B3C3；22.A2B1C3；23.A2B2C3；24.A2B3C3；25.A3B1C3；26.A3B2C3；27.A3B3C3；图1-8净化剂用量考察TLC鉴别图谱Fig.1-8TLCchromatogramsofCleaningagentsamount14 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文3.2展开剂的考察实验中分别考察了系统（1）四氢呋喃-乙酸乙酯-异丙醇-氨水（4∶3∶6∶3）；（2）三氯甲烷-甲醇-乙酸乙酯-氨水（16∶10∶4∶3）；（3）三氯甲烷-甲醇-乙酸乙酯-氨水（15∶10∶7∶3）；（4）三氯甲烷-甲醇-乙酸乙酯-氨水-水（15∶10∶4∶2∶1）（下层溶液）四种展开系统，进行比较。实验结果表明系统1，6种喹诺酮基本分开呈6个点；系统2，6种喹诺酮只呈现5个点其中恩诺诺沙星和沙拉沙星无法分离；系统3，只呈现5个点其中单诺沙星和恩诺沙星无法分离；系统4，6种喹诺酮均能分离且Rf值在0.2-0.8之间。故选择系统4以三氯甲烷-甲醇-乙酸乙酯-氨水-水（15∶10∶4∶2∶1）（下层溶液）为展开剂，饱和15min，直立上行展开取出，晾干。在紫外365nm下观察6种氟喹诺酮的斑点并测量Rf值进行定性。如图1-9所示。ABCD注：A.系统四氢呋喃-乙酸乙酯-异丙醇-氨水（4∶3∶6∶3）；B.系统三氯甲烷-甲醇-乙酸乙酯-氨水（16∶10∶4∶3）；C.系统三氯甲烷-甲醇-乙酸乙酯-氨水（15∶10∶7∶3）；D.系统三氯甲烷-甲醇-乙酸乙酯-氨水-水（15∶10∶4∶2∶1）图1-9不同展开系统TLC鉴别图谱Fig.1-9TLCchromatogramsofdifferentexpandedsystem3.3显色剂的考察取“1.2.2”项下混合对照标准使用溶液，按“1.2.6”项下条件点样，分别点0.5、1、2、3、5、7、9、10、15μL，按“1.2.7”项下条件进行展开及检视。本15 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文实验分别考察了三氯化铕和三氯化铽两种显色剂的显色效果。实验结果表明相同浓度下三氯化铽显色效果优于三氯化铕，实验又考察了1%、3%、5%、7%四个不同浓度的三氯化铽乙醇溶液，结果显示：1%三氯化铽乙醇溶液显色后几乎没有什么变化，3%、5%和7%三氯化铽乙醇溶液显色后效果相差不大，斑点明显易于观察。故选择3%三氯化铽乙醇溶液作为最终显色剂。如图1-10所示。ABCD16 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文EF注：A.2%三氯化铕；B.2%三氯化铽；C.1%三氯化铽；D.3%三氯化铽；E.5%三氯化铽；F.7%三氯化铽图1-10显色剂考察TLC鉴别图谱Fig.1-10TLCchromatogramsofChromogenicagent4结论目前世界各国对于动物源性食品中药物的残留多采用高效液相色谱法以及色谱质谱联用技术。我国食品安全国家标准GB/T23412-2009《蜂蜜中19种喹诺酮类药物残留的测定》也采用液相色谱-串联质谱法。但由于液相和质谱仪器较为昂贵很难在基层得以推广。薄层色谱法（TLC）因具有对被分离物质的适用范围广、可同时进行多个样品的分离、设备仪器价格低廉、得到的信息丰富、分析速度快等优点，成为基层单位的首选。对于蜂蜜中氟喹诺类药物残留检测的薄层色谱法相关研究甚少，现有的方法检出限也较高。本章采用薄层色谱法(TLC)同时对蜂蜜中可能残留的6种氟喹诺酮药物进行检测方法的研究。以三氯甲烷-甲醇-乙酸乙酯-氨水-水（15∶10∶4∶2∶1）下层溶液为展开剂，Merck板为固定相，镧系元素铽为显色剂，对蜂蜜中残留的6种氟喹诺酮进行薄层色谱定性鉴别。饱和15min后上行展开，取出，晾干，再喷以3%的三氯化铽乙醇溶液，在105℃烘1min，取出，冷至室温，在365nm波长下检视。诺氟沙星、环丙沙星、单诺沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、双氟沙星6斑点分离较好，Rf值0.2～0.8。建立的薄层色谱法可同时对蜂蜜中6种氟喹诺酮药物残留进行17 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文快速筛查。方法简便、快捷、专属性和耐用性良好、在同类方法中检出限低，适用动物源性食品蜂蜜中氟喹诺酮类药物残留的鉴别。对于缺少大型设备仪器的基层机构该方法尤为适用。18 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文第二章蜂蜜中6种氟喹诺酮类药物残留高效液相检测方法研究1材料与方法1.1材料表2-1主要实验仪器Table2-1Themainexperimentalinstruments编号仪器名称型号生产厂家1电子分析天平XS205Mettler-Toledo仪器有限公司2恒温水浴锅DK-98-ⅡA天津市泰斯特仪器有限公司3涡旋仪TALBOYS美国亨利特里姆有限公司4医用离心机TD6M昆山市超声仪器有限公司5纯水机Direct-Q3美国密理博公司高效液相色谱仪UltiMate3000荧光检测器FLD-3400RS柱温箱TCC-30006美国戴安公司泵LPG-3400SD自动进样器WPS-3000SplitLoop色谱数据工作站Chromeleon1.1.1对照品对照品同第一章“1.1.1”项下对照品1.1.2试剂乙腈（色谱纯美国天地试剂公司）；乙酸(分析纯重庆日东化工有限公司)；Mcllvaine缓冲液（pH4）：磷酸氢二钠27.6g、柠檬酸12.9g、乙二胺四乙酸二钠37.2g(分析纯重庆日东化工有限公司)，用水溶解后稀释并定容至1000mL；N-正丙基乙二胺（PSA）(美国SELECTRA公司)。1.1.3样品来源样品来源同第一章“1.1.3”项下样品来源。1.2方法1.2.1标准使用溶液标准贮备溶液：分别精密称取对照品，诺氟沙星0.01089g，环丙沙星0.0107019 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文g，单诺沙星0.01081g，恩诺沙星0.01011g，沙拉沙星0.01027g，双氟沙星0.01022g分别置于10mL容量瓶中，用200μL甲酸溶解后，再用甲醇稀释至刻度，摇匀。中间工作对照品溶液：精密吸取上述溶液1.00mL分别置于100mL容量瓶中，用甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，即得相应浓度分别为10.8356，10.1650，10.1614，9.9584，9.8079，9.9645µg/mL的中间工作对照品溶液。标准使用溶液：精密吸取诺氟沙星、环丙沙星、单诺沙星、恩诺沙星、双氟沙星标准贮备溶液1.00mL、单诺沙星标准贮备溶液0.20mL分别置于10mL容量瓶，用0.2%甲酸水溶液稀释至刻度，摇匀，即得相应浓度分别为1.0836，1.0165，0.9958，0.9808，0.9964，0.2032µg/mL的标准使用溶液。1.2.2混合对照标准使用溶液分别精密吸取恩诺沙星、沙拉沙星、双氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星标准贮备溶液1.00mL、单诺沙星标准贮备溶液0.20mL至同一100mL容量瓶，用0.2%甲酸水溶液稀释至刻度，摇匀，即得相应浓度分别为0.09958，0.09808，0.09964，0.10836，0.10166，0.02032µg/mL的混合对照标准使用溶液。1.2.3供试样品溶液称取供试样品5.00g（准确至0.01g），置100mL离心管中，加入Mcllvaine缓冲液5mL，涡旋3min，加入含5%乙酸的乙腈溶液至50mL涡旋10min后加入无水硫酸镁5g涡旋2min，离心（5000r/min，5min），吸取上清液25mL至60mm蒸发皿40℃水浴挥干，用流动相定容至2mL，加入MgSO4、NaCl、PSA0.3g涡旋1min离心（5000r/min，5min），取上清液0.45μm有机微孔滤膜过滤作待测溶液。1.2.4模拟阳性样品溶液称取供试样品5.00g（准确至0.01g），置100mL离心管中，加入混合标准溶液1mL，Mcllvaine缓冲液5mL，涡旋3min，加入含5%乙酸的乙腈溶液至50mL涡旋10min后加入无水硫酸镁5g涡旋2min，离心（5000r/min，5min），吸取上清液25mL至60mm蒸发皿40℃水浴挥干，用流动相定容至2mL，加入MgSO4、NaCl、PSA各0.3g涡旋1min离心（5000r/min，5min），取上清液0.45μm有机微孔滤膜过滤作阳性样品溶液。1.2.5色谱条件20 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文色谱柱：UltimateXB-C18柱(250×4.6mm，5µm)；柱温30℃；流动相以乙腈为A相，以0.2%甲酸水溶液为B相（A∶B=13∶87）等度洗脱；流速为1.0mL/min；FLD检测器；激发波长280nm发射波长450nm；进样量：10μL；根据保留时间定性，峰面积定量。1.3系统适用性实验分别取混合对照标准使用溶液、阴性样品溶液和阳性样品溶液注入液相色谱仪，按“1.2.5”项下色谱条件进行测定，记录色谱图。从图中可见，诺氟沙星、环丙沙星、单诺沙星、恩诺沙星、沙拉沙星和双氟沙星的保留时间分别为15.75min、17.97min、24.24min、25.95min、41.55min、44.23min。阴性样品溶液在诺氟沙星、环丙沙星、单诺沙星、恩诺沙星、沙拉沙星和双氟沙星位置处无干扰峰，阳性样品溶液中各目标组分分离完全（分离度>1.5），理论塔板数按诺氟沙星峰计算不低于6000，对称因子、拖尾因子均满足要求。表明本方法系统适用性良好。如图2-1、2-2、2-3所示。注：1.诺氟沙星（Norfloxacin）；2.环丙沙星（Ciprofloxacin）；3.单诺沙星（Danofloxacin）；4.恩诺沙星（Enrofloxacin）；5.沙拉沙星（Sarafioxacin）；6.双氟沙星（Difloxacin）；图2-16种氟喹诺酮标准物质混标色谱图Fig.2-1HPLCchromatogamsofsixkindsoffluoroquinolones图2-2阴性样品色谱图Fig.2-2chromatogamsofnegativesamples21 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文注：1.诺氟沙星（Norfloxacin）；2.环丙沙星（Ciprofloxacin）；3.单诺沙星（Danofloxacin）；4.恩诺沙星（Enrofloxacin）；5.沙拉沙星（Sarafioxacin）；6.双氟沙星（Difloxacin）；图2-3阳性样品色谱图Fig.2-3chromatogamsofPositivesamples1.4方法学考察参照2010版《中国药典》附录ⅩⅧ中药分析方法验证指导原则实施细则和国家标准GB/T27404-2008《实验室质量控制规范食品理化检测》附录检测方法确认的技术要求进行方法学确认。1.4.1线性关系考察按“1.2.2”项下混合对照标准使用溶液配制方法，配制浓度分别为20，50，100，200，300，500ng/mL混合对照标准使用溶液，按“1.2.5”项下色谱条件进行测定，测定峰面积值，以混合对照品溶液的浓度为横坐标(X)，以相应的峰面积为纵坐标(Y)进行线性回归，回归方程见表2-2，线性关系如图2-4所示。实验结果表明6种氟喹诺酮在20～500ng/mL浓度范围内线性关系良好(r=0.9999)。表2-26种氟喹诺酮的线性方程（n=6)Table2-2Linearequationsofsixoffluoroquinolones（n=6)名称线性方程相关系数（r）浓度范围/ng诺氟沙星y=1010.70x+2067.470.999821.67～541.78环丙沙星y=675.02x-850.080.999820.35～508.73单诺沙星y=5234.52x-2071.320.99994.06～101.61恩诺沙星y=1285.30x-2915.310.999919.92～497.92沙拉沙星y=454.06x+640.110.999919.62～490.39双氟沙星y=896.68x-860.780.999919.93～498.2222 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文600000y=1010.7x+2067.5400000R2=0.9998y=675.02x-850.083500002500000R=0.9997300000400000系列1系列1250000300000200000线性150000线性200000(系列(系列1)1000001)100000500000001002003004005006000100200300400500600AB600000700000y=1285.3x-2915.3y=5234.5x-2071.322R=0.9999500000R=0.9999600000系列1500000400000系列1400000300000300000线性线性200000(系列200000(系列1)1000001)100000000204060801001200100200300400500600CD250000500000y=454.06x+640.11y=896.6845x-860.77882450000R2=0.9999R=1200000400000350000系列1150000300000系列1250000100000线性200000(系列150000线性1)(系列1)50000100000500000001002003004005006000100200300400500600EF注：A.诺氟沙星（Nrofloxacin）；B.环丙沙星（Ciprofloxacin）；C丹诺沙星（Danofloxacin）；D.恩诺沙星（Enrofloxacin）；E.沙拉沙星（Sarafloxacin）；F.双氟沙星（Difloxacin）图2-46种氟喹诺酮的标准工作曲线Fig.2-4Thestandardcurveofofsixfluoroquinolones23 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文1.4.2仪器精密度实验按“1.2.2”项下混合对照标准使用溶液制备方法，制备浓度为0.1µg/mL混合对照标准使用溶液，按“1.2.5”项下色谱条件进行测定，连续重复进样6次，测定峰面积。结果：诺氟沙星、环丙沙星、单诺沙星、恩诺沙星、沙拉沙星和双氟沙星的平均峰面积分别为109949.8、67128.2、105524.8、121202.5、44809.8、86971.8；RSD分别为0.46%、0.29%、0.13%、0.42%、0.37%、0.24%，表明仪器精密度良好。精密度实验结果见表2-3，精密度色谱叠加图如图2-5所示。表2-3仪器精密度实验结果Table2-3TheresultsofInstrumentprecision进样次数峰面积平均值RSD%123456A诺氟沙星109205109611109801110163110514110405109949.80.46A环丙沙星66869669376709667218673546729567128.20.29A单诺沙星105529105277105611105613105625105494105524.80.13A恩诺沙星120596121543121242120565121611121658121202.50.42A沙拉沙星44756447724493844806450314455644809.80.37A双氟沙星86736869358717986851872768685486971.80.24图2-5仪器精密度色谱叠加图Fig.2-5ThechromatogramsofInstrumentprecision1.4.3回收率实验称取空白样品9份，均分三组，每组分别加入浓度为0.03，0.05，0.1µg/mL的混合对照标准使用溶液1mL。按“1.2.3”项下供试样品溶液制备方法制备样品溶液，按“1.2.5”项下色谱条件进行测定。记录各组分的峰面积，实测值与加24 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文入值之比，即为方法回收率。计算回收率及相对标准偏差(RSD)。6种氟喹诺酮的回收率在72.08%～109.83%，RSD在1.59%～12.16%。实验结果表明该方法回收率较好。结果见表2-4。回收率色谱叠加图如图2-6所示。表2-46种氟喹诺酮的回收率Table2-4Recoveriesofsixfluoroquinolones平均回RSD/名称添加量/µg峰面积测得样品中的量/µg收率/%%0.032517986；7893；80840.02342；0.02306；0.0238172.08诺氟0.0541813275；13177；130470.04436；0.04397；0.0434581.0811.71沙星0.108427006；27109；269480.09869；0.09911；0.0984791.140.030524624；4976；47080.03244；0.03452；0.03294109.09环丙0.058710695；10461；104810.06841；0.06703；0.06715114.713.02沙星0.101817431；18276；177570.1083；0.1133；0.1103108.740.0060976136；6072；60950.006272；0.006223；0.006317102.85单诺0.0101612171；12065；123920.01088；0.01080；0.01105107.392.34沙星0.0203225580；25193；255990.02113；0.02083；0.02114103.520.029886094；6146；61260.02804；0.02819；0.0281494.14恩诺0.0497914447；14652；148700.05403；0.05467；0.05535109.838.28沙星0.0995831676；32000；314180.1077；0.1087；0.1068108.170.029423021；2979；31140.02094；0.02060；0.0217971.79沙拉0.049045352；5416；52230.04151；0.04208；0.0403784.2612.16沙星0.0980811001；10852；106840.09127；0.08996；0.0884891.660.029896113；6335；62110.03111；0.03210；0.03155105.66双氟0.0498211162；10839；110600.05363；0.05219；0.05318106.381.59沙星0.0996522853；23460；227460.1058；0.1085；0.1053108.9025 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文图2-6回收率色谱图Fig.2-6Thechromatogramsofrecoveryrate1.4.4重复性实验取同一批样品，按“1.2.4”项下模拟阳性样品溶液制备方法，平行制备6份含量为20µg/kg的供试品溶液，按“1.2.5”项下色谱条件进行测定6种氟喹诺酮含量，记录色谱图，测定峰面积，计算RSD%。6种氟喹诺酮的RSD为0.71%～3.05%。实验证明本方法重复性较好。结果见表2-5，色谱叠加图如图2-7所示。表2-56种氟喹诺酮重复性实验结果Table2-5repetitiveresultsofsixfluoroquinolones样品峰面积平均值RSD%123456A诺氟沙星27106269022751826692268872711527036.71.05A环丙沙星17731180421821617956178951815717999.50.99A单诺沙星25088254782514725386254432551225342.30.71A恩诺沙星31876320043194430889321503261231912.51.77A沙拉沙星10955108871102211153109211178611120.73.05A双氟沙星22853231052292122887227842356823019.71.26图2-7重复性色谱图Fig.2-7Thechromatogramsofrepetitive26 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文1.4.5方法检出限称取空白样品3份，分别加入浓度为0.01，0.02，0.05µg/mL的混合对照标准使用溶液1mL。按“1.2.3”项下供试样品溶液制备方法，制备样品溶液，按“1.2.5”项下色谱条件进行测定。以信噪比S/N=3的方法计算检出限。诺氟沙星、环丙沙星、单诺沙星、恩诺沙星、沙拉沙星和双氟沙星6种喹诺酮的检出限分别为1.08、1.65、0.97、1.99、3.91、1.98μg/kg。如图2-8所示。图2-8检出限色谱图Fig.2-8Thechromatogramsofdetectionlimit1.4.6耐用性实验实验选用①WatersX-BridgeC18(4.6mm×250mm，5μm)，柱号：186003117，Waters科技有限公司；②UltimateXB-C18(4.6mm×250mm，5μm)，柱号：00201-31043，月旭科技有限公司；③TechMateST-C18(4.6mm×250mm，5μm)，柱号：T10541，北京泰克美高新技术有限公司3根不同柱子制造商生产的不同品牌的色谱柱进行耐用性考察。使用上述3种色谱柱对浓度为0.1µg/mL混合对照品溶液进行测定。结果表明：6种氟喹诺酮能实现良好的分离。诺氟沙星、环丙沙星、单诺沙星、恩诺沙星、沙拉沙星和双氟沙星的平均峰面积分别为109639.0、68500.3、103008.7、123442.3、44363.0、86130.333；RSD分别为1.42%、1.27%、1.19%、1.22%、1.25%、1.91%。实验表明该方法的耐用性良好。耐用性实验结果见表2-6。耐用性色谱图如图2-9所示。27 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文表2-6耐用性实验验结果Table2-6Thetestresultsofdurability氟喹诺酮名称参色谱柱诺氟环丙单诺恩诺沙拉双氟数沙星沙星沙星沙星沙星沙星WatersX-BridgeC18tR15.417.623.726.340.643.2(4.6×250mm，5µm)n157751718718261179731799918013R3.36.84.18.31.8/A108138675421019951218764342985112UltimateXB-C18tR15.918.124.527.242.144.7(4.6×250mm，5µm)n158981647716941172971824117932R4.23.53.13.22.1/A109542687141026081234974458286276TechMateST-C18tR16.719.125.929.346.049.5(4.6×250mm，5µm)n152151619317313173741738517155R4.29.74.114.62.0/A111237692451044231249544507887003AB28 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文C注：A.WatersX-BridgeC18；B.UltimateXB-C18；C.TechMateST-C18图2-9三种不同品牌色谱柱的色谱图Fig.2-9TheChromatogramsofthreedifferentbrandsofchromatographiccolumn2结果对市售的30批样品，按“1.2.3”项下供试样品溶液制备方法处理，按“1.2.5”项下色谱条件进行测定。结果：根据样品与对照品溶液的保留时间定性、峰面积定量，判断各样品中氟喹诺酮残留的种类及含量。检测发现4号和12号样品诺氟沙星呈阳性，结果为65.34µg/kg和22.76µg/kg。如图2-10所示。AB注：A.4号样品（No.4sample）；B.12号样品（No.12sample）图2-10阳性样品色谱图Fig.2-10TheChromatogramsofpositivesamples29 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文3讨论3.1样品前处理方法考察3.1.1稀释液及提取溶剂酸度的考察目前对于食品等复杂基质样品中喹诺酮类药物的提取，较为成熟的溶剂是乙腈，由于蜂蜜基质的特殊性，在实验过程中发现直接加入乙腈提取时蜂蜜会变成胶质状，因此在加入提取溶液前加入水或适当的缓冲液进行稀释，使之形成均相体系，以便目标化合物的提取。实验对比了水、Mcllvaine缓冲液和磷酸盐缓冲液（pH7.2）3种稀释液。实验证明Mcllvaine缓冲液稀释效果最好。本实验比较了1%乙酸乙腈、3%乙酸乙腈、含5%乙酸的乙腈和7%乙酸乙腈四种不同酸度的乙腈对目标物提取效果的影响，实验发现随着乙酸比列的增大提取效果呈递增趋势，含5%乙酸的乙腈与7%乙酸乙腈提取效果无明显区别，故最终选择含5%乙酸的乙腈作为提取溶剂。结果见表2-7。表2-7不同提取溶剂酸度实验结果Table2-7Theresultofdifferentofextractionsolvents测定结果峰面积1%3%5%7%A诺氟沙星49114522805963859214A环丙沙星23107291723311533237A单诺沙星43261484455317353448A恩诺沙星55006593356521265182A沙拉沙星10865149682100621203A双氟沙星360964219846352460357000060000500001%乙酸乙腈400003%乙酸乙腈5%乙酸乙腈300007%乙酸乙腈20000100000诺氟沙星环丙沙星单诺沙星恩诺沙星沙拉沙星双氟沙星图2-11不同提取溶剂酸度实验结果Fig.2-11Theresultofdifferentofextractionsolvents30 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文3.1.2提取方法的考察在实验过程中分别采用超声波、涡旋振荡和超声波加涡旋振荡三种提取方法进行考察，实验表明：超声波提取操作简便但提取不完全，涡旋振荡加超声与单独涡旋振荡提取效果相近且时间长，故选择涡旋振荡为提取方法。结果见表2-8。表2-8不同提取方法实验结果Table2-8Theresultofdifferentofextractionmethods峰面积测定结果超声涡旋超声+涡旋A诺氟沙星222805963859514A环丙沙星121723311533637A单诺沙星284455317353848A恩诺沙星393356521265382A沙拉沙星99682100621403A双氟沙星231984635246935图2-12不同提取方法实验结果Fig2-12Theresultofdifferentofextractionmethods3.1.3提取次数的考察在实验过程中分别考察了涡旋振荡提取1次、2次和3次对提取效果的影响，提取时间第一次为10分钟，第二次提取为5分钟，第三次提取时间为1分钟，结果发现提取1次就能提取完全，故最终确定提取次数为1次。结果见表2-9。31 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文表2-9提取次数实验结果Table2-9Theresultofextracttimes提取次数峰面积1次2次3次A诺氟沙星592145944659423A环丙沙星332373332133447A单诺沙星534485355153602A恩诺沙星651826541565618A沙拉沙星212032199222017A双氟沙星46035467944678770000600005000040000提取1次提取2次30000提取3次20000100000诺氟沙星环丙沙星单诺沙星恩诺沙星沙拉沙星双氟沙星图2-13提取次数实验结果Fig2-13Theresultofextracttimes3.1.4净化方法的考察在论文的第一章薄层色谱法测定蜂蜜中6种氟喹诺酮类药物残留的研究中，实验对于近年来在农兽药残留应用广泛的样品前处理技术-分散固相萃取（QuEChERS）技术进行了探索。但目前对于氟喹诺酮类药物残留的净化大多选择固相萃取方法。故此实验对SPE、HLB、C18三种固相萃取小柱和分散固相萃取（MgSO4、NaCl、PSA各0.3g）净化效果进行对比。实验证明HLB小柱对单诺沙星、恩诺沙星以及双氟沙星等物质的吸附作用过强，不易洗脱，回收率过低，C18小柱对单诺沙星吸附作用过强，不易洗脱，回收率过低，所以HLB和C18这2款小柱不适合用于该6种成分的净化。SPE小柱和分散固相萃取净化方法对六32 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文种氟喹诺酮的选择性较好，SPE小柱有一定的净化效果，但其操作步骤繁琐、费用较高且回收率低。因此实验选择分散固相萃取方法进行净化。色谱图如图2-14所示。AB沙拉沙星CD注：A.HLB小柱（HLBsmallcolumn）；B.C18小柱（C18smallcolumn）；C.SPE小柱（SPEsmallcolumn）；D.分散固相萃取（Dispersivesolid-phaseextraction）图2-14净化方法考察色谱图Fig.2-14Thechromatogramsofthepurificationmethod33 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文3.2色谱条件考察3.2.1流动相的考察目前有关液相色谱法测定氟喹诺酮含量的研究报道中大部分选用的流动相为磷酸/三乙胺、磷酸盐/四丁基溴化铵、磷酸/庚烷磺酸钠体系分离喹诺酮类。实验条件比较苛刻，含盐不易冲洗易造成柱子和检测器堵塞，在实验中发现能满足条件的色谱柱使用寿命也较短，所以不可取。参考国标方法（GB/T5009.141-2003和GB/T23496-2009）和相关参考文献的基础上，实验对比了0.05moL/L磷酸水溶液-三乙胺（pH2.5、3.0、3.5）和0.2%甲酸水溶-乙腈（90∶10、87∶13、85∶15、80∶20）作流动相时6种目标物的分离情况，发现选用0.2%甲酸水溶液作为流动相时6种目标氟喹诺酮能得到很好的分离，理论塔板数、对称因子、拖尾因子均满足要求，且实验条件较温和，不会对色谱柱造成损伤。随着乙腈比例的增大，出峰时间随之提前。综合考虑杂质及成本等问题，最终选定0.2%甲酸水溶-乙腈(87∶13)作为流动相如图2-15所示。图2-150.2%甲酸水溶液-乙腈（87∶13）为流动相Fig.2-15Thechromatogramof0.2%formicacidandacetonitrile(87∶13)asmobilephase3.2.2柱温的考察在流速为1.0mL/min的条件下，分别考察在25℃、30℃、40℃三种柱温条件下对系统适用性参数的影响，结果表明：随着柱温升高，各组分出峰加快，峰形趋于对称。但综合考虑到温度高会对影响色谱柱的使用寿命。故本研究选择30℃为柱温。结果如图2-16所示。34 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文注：从上至下依次为25℃、30℃、40℃图2-16不同柱温考察的色谱图Fig.2-16Thechromatogramsofdifferentofcolumntemperatures3.2.3流速的考察在柱温30℃的条件下，考察0.8mL/min、1.0mL/min、1.2mL/min三个流速对系统适用性参数的影响，结果表明：三种不同流速对保留时间、理论塔板数、分离度的影响不大，本研究采用实验最佳流速1.0mL/min。结果如图2-17所示。注：从上至下依次为0.8mL/min、1.0mL/min、1.2mL/min图2-17不同流速考察的色谱图Fig.2-17Thechromatogramsofdifferentofflowrates4结论目前，高效液相色谱色谱法测定蜂蜜中氟喹诺酮药物残留的相关研究报道很少。现有标准及筛查技术已不能充分满足食品安全的监管需求。完善食品标准中有关药物残留检测指标、限量及检测方法，探索高通量快速检测技术，可节约检测成本，加大食品监管力度。高效液相色谱法（HighPerformanceLiquidChromatography，HPLC）具有灵敏度高、重现性好、准确度高等特点，是目前在含量测定方法运用最多的方法对于动物源性食品中氟喹诺酮类药物残留的检测具有很高的应用前景，现有液相方法检出限普遍偏高，降低方法检出限是亟待解决的课题。35 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文本章采用高效液相色谱法结合荧光检测器(HPLC-FLD)同时对蜂蜜中可能残留的6种氟喹诺酮药物进行检测方法的研究。样品经分散固相萃取（QuEChERS）技术处理后，采用UltimateXB-C18(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱，以0.2%甲酸水溶-乙腈(87:13)作为流动相等度洗脱。流速：1.0mL/min，柱温：30℃。结果显示6种氟喹诺酮20～500ng/mL浓度范围内呈良好的线性关系(r=0.9999)。样品加标平均回收率在70.93%～111.16%，相对标准偏差（RSD）在0.29%～3.27%之间。与目前研究报道的方法相较,本研究建立的方法重现性较好、检出限低。采用分散固相萃取（QuEChERS）样品前处理技术处理，相比传统的固相萃取小柱，简化了样品前处理的分析步骤有效的减免一些繁琐且不必要的操作流程，有效的节约了分析检测的时间和成本，进而提高了日常大批量样品的检测效率，适用于检测机构对蜂蜜中可能残留的氟喹诺酮类药物进行定量筛查。36 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文第三章蜂蜜中6种氟喹诺酮类药物残留液质联用检测方法研究1材料与方法1.1材料表3-1主要实验仪器Tables3-1Themainexperimentalinstruments编号仪器名称型号生产厂家1电子分析天平XS205Mettler-Toledo仪器有限公司2恒温水浴锅DK-98-ⅡA天津市泰斯特仪器有限公司3涡旋仪TALBOYS美国亨利特里姆有限公司4医用离心机TD6M昆山市超声仪器有限公司5氮吹仪TTL-DCI余姚市长江温度仪表厂超高效液相色谱仪1290二极管阵列检测器G4212A系统控制器G4227A6泵G4220A美国安捷伦公司自动进样器G4226A色谱数据工作站MassHunter7三重四级杆质谱仪64601.1.1对照品对照品同第一章“1.1.1”项下对照品1.1.2试剂乙腈（色谱纯美国天地试剂公司）；甲酸铵、乙腈（色谱纯美国天地试剂公司）；Mcllvaine缓冲液（pH4）：磷酸氢二钠27.6g、柠檬酸12.9g、乙二胺四乙酸二钠37.2g(分析纯重庆日东化工有限公司)，用水溶解后稀释并定容至1000mL；N-正丙基乙二胺（PSA）(美国SELECTRA公司)。1.1.3样品来源样品来源同第一章“1.1.3”项下样品来源。1.2方法1.2.1标准使用溶液37 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文标准贮备溶液：分别精密称取对照品，诺氟沙星0.01038g，环丙沙星0.01023g，单诺沙星0.01059g，恩诺沙星0.01044g，沙拉沙星0.01028g，双氟沙星0.01037g分别置于10mL容量瓶中，用200μL甲酸溶解后，再用甲醇稀释至刻度，摇匀。中间工作对照品溶液：精密吸取上述溶液1.00mL分别置于100mL容量瓶，用含0.1%甲酸的甲酸铵溶液稀释至刻度，摇匀，即得相应浓度分别为10.3182，9.7185，9.9546，10.2834，9.8174，10.2243µg/mL的中间工作对照品溶液。标准使用溶液：精密吸取标准贮备溶液1.00mL分别置于10mL容量瓶，用含0.1%甲酸的甲酸铵溶液稀释至刻度，摇匀，即得相应浓度分别为1.0318，0.9719，0.9955，1.0283，0.9817，1.0224µg/mL的标准使用溶液。1.2.2混合对照标准使用溶液分别精密吸取诺氟沙星、环丙沙星、单诺沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、双氟沙星标准贮备溶液1.00mL至同一100mL容量瓶，用含0.1%甲酸的甲酸铵溶液稀释至刻度，摇匀，即得相应浓度分别为0.1032，0.09719，0.09955，0.1028，0.09817，0.1022µg/mL的混合对照标准使用溶液。1.2.3供试样品溶液称取供试样品5.00g（准确至0.01g），置50mL离心管中，加入Mcllvaine缓冲液5mL，涡旋3min，加入含5%乙酸的乙腈溶液至40mL涡旋10min后加入无水硫酸镁5g涡旋2min，离心（5000r/min，5min），吸取上清液25mL至60mm蒸发皿40℃水浴挥干，加入2mL含0.1%甲酸的甲酸铵溶液溶解，加入MgSO4、NaCl、PSA各0.3g涡旋1min离心（5000r/min，5min），取上清液氮吹仪吹至1mL，0.22μm有机微孔滤膜过滤作待测溶液。1.2.4模拟阳性样品溶液称取供试样品5.00g（准确至0.01g），置50mL离心管中，加入混合标准溶液1mL，Mcllvaine缓冲液5mL，涡旋3min，加入含5%乙酸的乙腈溶液至40mL涡旋10min后加入无水硫酸镁5g涡旋2min，离心（5000r/min，5min，吸取上清液25mL至60mm蒸发皿40℃水浴挥干，加入2mL含0.1%甲酸的甲酸铵溶液溶解，加入MgSO4、NaCl、PSA各0.3g涡旋1min离心（5000r/min，5min），取上清液氮吹仪吹至1mL，0.22μm有机微孔滤膜过滤作待测溶液。38 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文1.2.5色谱条件色谱柱：AgilentZORBAXSB-C18柱(2.1mm×50mm，1.8µm)，柱号827700-902；柱温：45℃；流速：0.5ml/min；进样量：2µL；流动相A为乙腈，B为含0.1%甲酸的甲酸铵溶液，采用梯度洗脱方式，梯度洗脱程序见表3-2。表3-2最佳梯度洗脱条件Table3-2Optimalelutionconditionsforninekindsofsyntheticpigments时间/minA（乙腈）%B（含0.1%甲酸的甲酸铵溶液）0.0059516.00138716.1098219.9098220.005951.2.6质谱条件电喷雾离子源ESI：正离子模式(ESI+)；扫描方式：多反应监测(MRM)；干燥气温度：300℃；干燥气流量：5mL/min；雾化气压力：50psi；鞘气温度：400℃；鞘气流量：12L/min；毛细管电压：(ESI+)为3000-3500kV；6种氟喹诺酮质谱参数见表3-3。表3-36种氟喹诺酮质谱参数Table3-3Massparametersofsixfluoroquinolones特征质荷比m/z锥孔碰撞能名称特征分子式模式离子母离子子离子电压V量eV27416-诺氟沙星C16H18FN3O3[M+H]320128ESI+3021222436-环丙沙星C17H18FN3O3[M+H]332138ESI+3141625440-单诺沙星C20H24FN3O6S[M+H]358138ESI+3402031420-恩诺沙星C19H22FN3O3[M+H]360123ESI+3421639 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文29724-沙拉沙星C20H17F2N3O3[M+H]386128ESI+3681635420-双氟沙星C21H19F2N3O3[M+H]400138ESI+382161.3系统适用性考察分别取混合对照品溶液、阴性样品溶液和阳性样品溶液依次UPLC-MS/MS分析测定，记录色谱图。从图中可见，阴性样品溶液在诺氟沙星、环丙沙星、单诺沙星、恩诺沙星、沙拉沙星和双氟沙星位置处无干扰峰，阳性样品溶液中各目标组分在7～15min各目标组分分离完全（分离度>1.5），理论塔板数、对称因子、拖尾因子均满足要求。表明本方法系统适用性良好。结果如图3-1、3-2、3-3所示。图3-16种氟喹诺酮标准物质混标总离子流(TIC)图Fig.3-1TheTICofsixkindsoffluoroquinolone图3-2阴性样品总离子流(TIC)图Fig.3-2TheTICofnegativesamples40 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文图3-3阳性样品总离子流(TIC)图Fig.3-3TheTICofPositivesamples1.4方法学考察1.4.1线性关系的考察按“1.2.2”项下混合对照标准使用溶液配制方法，配制浓度分别为2、10、20、40、60、100ng/mL混合对照标准使用溶液，依次经UPLC-MS/MS分析测定，以混合对照标准使用溶液浓度为横坐标(X)，以相应的峰面积为纵坐标(Y)进行线性回归。实验结果表明6种氟喹诺酮在2～100ng/mL浓度范围内线性关系良好。回归方程见表3-4，线性关系如图3-4所示。表3-46种氟喹诺酮的线性方程（n=6)Table3-4Linearequationsofsixfluoroquinolones名称线性方程相关系数（r）浓度范围/ng诺氟沙星y=909.11x-1630.130.99902.07～103.40环丙沙星y=769.68x-1178.30.99951.83～92.16单诺沙星y=3032.02x-9404.230.99681.67～83.46恩诺沙星y=2206..57x-7524.840.99832.06～102.83沙拉沙星y=642.65x-1042.160.99951.89～93.92双氟沙星y=1711.77x-3561.290.99901.90～95.0241 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文ABCD42 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文EF注：A.诺氟沙星（Nrofloxacin）；B.环丙沙星（Ciprofloxacin）；C丹诺沙星（Danofloxacin）；D.恩诺沙星（Enrofloxacin）；E.沙拉沙星（Sarafloxacin）；F.双氟沙星（Difloxacin）图3-46种氟喹诺酮的标准工作曲线Fig.3-4Thestandardcurveofofsixfluoroquinolones1.4.2回收率实验称取空白样品9份，均分三组，每组分别加入浓度为0.01，0.02，0.03µg/mL的混合对照标准使用溶液1mL。按“1.2.3”项下供试样品溶液制备方法，制备样品溶液，依次经UPLC-MS/MS分析测定。计算回收率及相对标准偏差(RSD)。6种氟喹诺酮的回收率在93.36%～129.75%，RSD在2.15%～12.23%。实验结果表明该方法回收率较好。结果见表3-5，回收率色谱图如图3-5、3-6、3-7所示。43 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文表3-56种氟喹诺酮的回收率Table3-5Recoveriesofsixfluoroquinolonesfromspkiedsamples添加平均RSD名称峰面积测得样品/ng量/ng回收率/%/%10.344351；4349；409910.53；10.52；9.77100.38诺氟沙星20.6812135；11994；1304524.23；23.98；25.83119.3512.2331.0214816；15337；1511628.94；29.86；29.4794.929.223537；3319；32559.80；9.35；9.22103.89环丙沙星18.439387；9196；959721.96；21.57；22.39119.238.9927.6512375；12307；1217428.17；28.03；27.76101.238.3510704；10670；1045010.61；10.59；10.48126.53单诺沙星16.6930037；28943；3099020.81；20.24；21.31124.546.3425.0443131；45542；4303027.72；28.99；27.67112.3510.288934；8904；896911.93；11.91；11.96129.48恩诺沙星20.5724634；23701；2701023.32；22.64；25.04115.065.9830.8539667；40695；3990034.22；34.96；34.39124.869.393211；3257；307110.59；10.70；10.24114.05沙拉沙星18.787709；7426；835721.79；21.08；23.40117.612.1528.1811010；12646；1081530.01；34.08；29.52112.869.508331；8563；790211.12；11.33；10.72119.97双氟沙星19.0018966；18887；2118321.06；20.98；23.13114.312.4528.5130485；32539；3107331.82；33.74；32.77118.0844 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文图3-5回收率色谱图（0.01µg/mL）Fig.3-5Thechromatogramsofrecoveryrate（0.01µg/mL）图3-6回收率色谱图（0.02µg/mL）Fig.3-6Thechromatogramsofrecoveryrate（0.02µg/mL）图3-7回收率色谱图（0.03µg/mL）Fig.3-7Thechromatogramsofrecoveryrate（0.03µg/mL）1.4.3重复性实验取同一批样品，按“1.2.4”项下模拟阳性样品溶液制备方法，平行制备6份样品含量为6µg/kg的供试品溶液，依次经UPLC-MS/MS分析测定响应值，45 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文计算RSD。6种氟喹诺酮的RSD为3.23%～3.94%。实验证明本方法重复性较好。结果见表3-6，色谱图如图3-8所示。表3-66种氟喹诺酮重复性实验结果Table3-6repetitiveresultsofsixfluoroquinolones样品峰面积平均值RSD%123456A诺氟沙星14438152201543015201141591529314952.33.47A环丙沙星12030122451217112123112771275412100.03.94A单诺沙星43214452184321943380435134666944202.23.23A恩诺沙星40034404384000639316389864338040360.03.89A沙拉沙星10612115021121410767106961129511014.33.35A双氟沙星29398319982994529674295393130330309.53.55图3-8重复性色谱图Fig.3-8Thechromatogramsofrepetitive46 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文1.4.4方法检出限称取空白样品3份，分别加入浓度为0.002、0.003、0.005µg/mL的混合对照标准使用溶液1mL。按“1.2.3”项下供试样品溶液制备方法制备次经UPLC-MS/MS分析测定。以信噪比S/N=3的方法计算检出限。经实验验证诺氟沙星、环丙沙星、单诺沙星、恩诺沙星、沙拉沙星和双氟沙星6种氟喹诺酮的检出限分别为0.41、0.31、0.24、0.26、0.31、0.19µg/kg。结果如图3-9、3-10所示。图3-9检出限色谱图Fig.3-9Thechromatogramsofdetectionlimit1.4.5耐用性实验实验对I.ACQUITYUPLCBEHHILICColumn，(1.7um，2.1mm×150mm)，Waters科技有限公司；II.AgilentZORBAXSB-C18柱(2.1mm×50mm，1.8µm)，安捷伦科技有限公司；III.AgilentZORBAXEclipsePlus-C18柱(2.1mm×50mm1.8µm)，安捷伦科技有限公司3根柱子对目标物的分离效果进行了考察。3根柱子在对6种氟喹诺酮的分离检测效果上无明显的差异。表明该方法的耐用性良好。如图3-10所示。A47 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文BC注：A.CQUITYUPLCBEHHILICColumn；B.AgilentZORBAXSB-C18；C.AgilentZORBAXEclipsePlus-C18图3-10三种不同品牌色谱柱的色谱图Fig.3-10TheChromatogramofthreedifferentbrandsofchromatographiccolumn2结果对市售的30批样品，“1.2.3”项下供试样品溶液制备方法处理，按“1.2.5”项下色谱条件和“1.2.6”项下质谱条件进行测定。所测定的结果若与对照品溶液的保留时间和母离子及所选择的两对子离子的质荷比一致，且供试品溶液中的定性离子相对丰度与对照溶液的定性离子相对丰度比进行比较时，相对标准偏差应在表3-7中规定的范围内。即可判定样品中存在氟喹诺酮的组分。检测发现4号和12号样品诺氟沙星呈阳性，结果为70.78µg/kg和24.89µg/kg。25号样品环丙沙星呈阳性，结果为1.34µg/kg。如图3-11所示。48 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文表3-7定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差Table3-7Relativeionabundancesofmaximumallowabledeviation相对离子丰度＞50%＞20%～50%＞10%～20%≤10%允许的最大偏差±20%±25%±30%±50%A49 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文BC注：A.4号样品（No.4sample）；B.12号样品（No.12sample）；C.25号样品（No.25sample）图3-11阳性样品色谱图Fig.3-11TheMRMofpositivesamples50 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文3讨论3.1色谱条件的考察3.1.1流动相的考察有机相的考察：实验对比了第二章高效液相方法中有机相乙腈及国家标准GB/T23412-2009中有机相甲醇、乙腈两种有机溶剂的洗脱效果。采用本法梯度洗脱分离6种氟喹诺酮时，均可达到良好的分离效果。但乙腈较甲醇黏度小，柱效高6种氟喹诺酮质谱响应信号乙腈较甲醇稍高；柱压低更有利于色谱柱和仪器的保护；故选择乙腈作为有机相。水相的考察：质谱多以缓冲液为水相，主要是因为少量的挥发性盐类可降低进入质谱雾化室内雾化液滴的表面张力，使目标化合物容易形成带电电荷，但当浓度过高时亦会竞争电离，从而抑制了目标物的电离信号。实验考察了在水相中添加挥发性盐甲酸铵和乙酸铵对结果的影响。实验表明：水相中加入甲酸铵时6种氟喹诺酮质谱信号响应较添加乙酸铵时强。实验同时考察了0.1%、0.2%和0.3%不同含量的甲酸对6种氟喹诺酮峰形的影响。结果表明甲酸含量为0.1%时6种氟喹诺酮峰形均较好。故此选择乙腈-含0.1%甲酸的甲酸铵溶液为流动相。3.2质谱条件碎裂电压的考察分别对6种氟喹诺酮进行全扫描以选择适当的电离方式和准分子离子峰。结果表明：诺氟沙星、环丙沙星、单诺沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、双氟沙星在+-ESI离子源模式下可获得较高丰度的[M-H]的母离子。全扫描是一级质谱，待测物产生较少碎片离子，锥孔电压对特征离子峰的价态形式和信号响应强度具有一定影响。实验进一步考察了锥孔电压从100～280V下分别对6种氟喹诺酮的信号响应值的影响。结果见表3-8。表3-8不同碎裂电压对6种氟喹诺酮的质谱信号响应值的结果Table3-8optimizationresultsofFragmentorforthesixfluoroquinolones信号值电压诺氟沙星环丙沙星单诺沙星恩诺沙星沙拉沙星双氟沙星100V816804467719823520663756882144239120V921105932423987622134459336158824140V89346701992451932134985824416111751 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文信号值电压诺氟沙星环丙沙星单诺沙星恩诺沙星沙拉沙星双氟沙星160V798456759822989919764346897149946180V665495342418275417995544538129342200V647824568216359215869939556112486图3-12不同碎裂电压对6种氟喹诺酮的质谱信号响应值的结果Fig.3-12optimizationresultsofFragmentorforthesixfluoroquinolones3.36种氟喹诺酮质谱裂解规律的探析3.3.1诺氟沙星裂解规律的探析诺氟沙星在正离子模式下扫描发现准分子离子峰m/z320，该离子信号为诺+氟沙星得到一个H所致，诺氟沙星在正离子模式锥孔电压为128V，碰撞能量12ev条件下发现主要碎片离子m/z302，推测是由m/z320失去一个H2O而得。增大碰撞能量至16ev发现主要碎片离子m/z274，推测是由m/z302继续失去一个CO而得。其具体的裂解规律如图3-13所示。52 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文图3-13诺氟沙星裂解规律探析Fig.3-13Themainpossiblefragmentationpathwayofnorfloxacin3.3.2环丙沙星裂解规律的探析环丙沙星沙星在正离子模式下扫描发现准分子离子峰m/z332，该离子信号+为环丙沙星得到一个H所致，环丙沙星在正离子模式锥孔电压为138V，碰撞能量16ev条件下发现主要碎片离子m/z314，推测是由m/z332失去一个H2O而得。增大碰撞能量至36ev发现主要碎片离子m/z224，推测是由m/z314继续失去CO、F、和C2NH5而得。其裂解规律探析如图3-14所示。图3-14环丙沙星裂解规律探析Fig.3-14ThemainpossiblefragmentationpathwayofCiprofloxacin53 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文3.3.3单诺沙星裂解规律的探析单诺沙星在正离子模式下扫描发现准分子离子峰m/z358，该离子信号为单+诺沙星得到一个H所致，单诺沙星在正离子模式锥孔电压为138，碰撞能量20ev条件下发现主要碎片离子m/z340，推测是由m/z358失去一个H2O而得。增大碰撞能量至40ev发现主要碎片离子m/z254，推测是由m/z340失去C3NH2、F、和CH3而得。其裂解规律探析如图3-15所示。图3-15单诺沙星裂解规律探析Fig.3-15ThemainpossiblefragmentationpathwayofDanofloxacin3.3.4恩诺沙星裂解规律的探析恩诺沙星在正离子模式下扫描发现准分子离子峰m/z360，该离子信号为恩+诺沙星得到一个H所致，恩诺沙星在正离子模式锥孔电压为123V，碰撞能量为16ev条件下发现主要碎片离子m/z342，推测是由m/z360失去一个H2O而得。增大碰撞能量至20ev发现主要碎片离子m/z314碎片离子，推测是由m/z342失去一个CO而得。其裂解规律探析如图3-16。54 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文图3-16恩诺沙星裂解规律探析Fig.3-16ThemainpossiblefragmentationpathwayofEnrofloxacin3.3.5沙拉裂解规律的探析沙拉沙星在正离子模式下扫描发现准分子离子峰m/z386，该离子信号为沙+拉沙星得到一个H所致，沙拉沙星在正离子模式锥孔电压为128V，碰撞能量为16ev条件下发现主要碎片离子m/z368，推测是由m/z386失去一个H2O而得。增大碰撞能量至24ev发现主要碎片离子m/z297，推测是由m/z368失去C2NH5和CO而得。其裂解规律探析如图3-17所示。55 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文图3-17沙拉沙星裂解规律探析Fig.3-17ThemainpossiblefragmentationpathwayofSarafioxacin3.3.6双氟沙星裂解规律的探析双氟沙星在正离子模式下扫描发现准分子离子峰m/z400，该离子信号为双+氟沙星得到一个H，双氟沙星在正离子模式锥孔电压为138V，碰撞能量为16ev条件下发现主要碎片离子为m/z382，推测是由m/z400失去一个H2O而得。增大碰撞能量至20ev发现主要碎片离子为m/z354，推测是由m/z382失去一个CO而得。其裂解规律探析如图3-18。56 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文图3-18双氟沙星裂解规律探析Fig.3-18ThemainpossiblefragmentationpathwayofDifloxacin4结论随着高效液相色谱的普及，在食品、药品等领域获得广泛的应用。简便、灵敏是高效液相色谱法的特点。但仍存在着一定的缺陷，仅通过保留时间和光谱图难以准确定性，而且分析时间较长，为弥补其缺陷，质谱技术应运而生。随着科学技术的发展，其在食品药品安全检测中发挥着越来越大的作用。气相色谱-质谱联用、高效液相色谱-质谱联用、高效液相色谱-原子光谱/质谱联用、高效液相色谱-电感耦合等离子/质谱联用、超临界流体色谱-电感耦合等离子-质谱联用等高新技术具有传统方法无法比拟的优势，既具有现代色谱对复杂样品的高分离能力，又发挥了质谱具有的高选择性、高灵敏度以及能够准确提供化合物的分子[40]。在检测动物源性食品中微乎其微的痕量药物残留时，色量与结构信息的优点谱与质谱联用可以说是最佳选择。本章采用液相色谱三重四级杆质谱联用法同时对蜂蜜中可能残留的6种氟喹诺酮药物进行检测方法的研究进行确证定性定量分析方法的研究。以AgilentZORBAXSB-C18柱(2.1mm×50mm，1.8µm)为色谱柱；柱温为45℃；流速0.5mL/min；进样量为2µL；流动相以乙腈为A相，含0.1%甲酸的甲酸铵溶液为B相进行梯度洗脱，电喷雾离子源ESI采用正离子模式(ESI+)；扫描方式采用多反应监测(MRM)；干燥气温度为300℃；干燥气流量：5mL/min；雾化气压力：50psi；鞘气温度：400℃；鞘气流量：12L/min；毛细管电压：(ESI+)为3000-3500kV；结果显示6种氟喹诺酮2～100ng/mL浓度范围内呈良好的线性关系57 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文(r=0.9999)。样品加标平均回收率在93.36%～129.75%，相对标准偏差（RSD%）在0.20%～9.06%之间。超高效液相色谱仪筛查时间为20min，缩短了分析时间，结果稳定，干扰小，选择性好，灵敏度高，为样品的高通量快速筛查提供可靠的技术支持，可应用于突发事件的快速应急处置工作。在定量测定上，本方法的检出限低于0.5µg/kg完全满足氟喹诺酮微量残留的含量测定。与我国目前采用食品安全国家标GB/T23412-2009《蜂蜜中19种喹诺酮类药物残留的测定》液质联用方法相比较检出限更低，前处理方法更为简便适用于有条件的检测机构对蜂蜜中可能残留的6种氟喹诺酮药物进行检测情况进行确证定性定量分析检测工作。58 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文结语本研究主要以动物源性食品蜂蜜中氟喹诺酮类药物残留为研究对象，研究残留检测方法，对薄层色谱法、高效液相色谱法、液相色谱仪串联质谱等3种不同检测方法进行了系统的研究，以满足不同检测目标、不同检测水平、不同实验室的需要。为动物源性食品中氟喹诺酮类药物残留评价奠定了研究基础。表4本研究与现有研究的比较Table4Thecomparativestudyofexistingresearch动物源性食品蜂蜜中六种氟喹诺酮药物残留检测方法研究方法回收率/%检出限适用范围/μg/kg样品经含5%乙酸的乙腈涡旋提适用于基取，离心取上清液，采用改进的层单位对分散固相萃取（QuEChERS）技蜂蜜中氟TLC术净化后作为供试品溶液，三氯20μg/kg喹诺酮类/甲烷-甲醇-乙酸乙酯-氨水-水残留的初（15∶∶∶∶10421）下层溶液为筛展开剂展开，取出，晾干，喷以显色剂3%三氯化铽；紫外365nm检视。本样品经前处理得到供试品溶液，研UltimateXB-C18（250×4.6mm，5适用于检究HPLCµm）色谱柱，柱温：30℃，以乙72%～109%0.97～3.91测机构大所腈∶0.2%甲酸水（13∶87）为流µg/kg规模抽检建动相，流速：1.0mL/min，荧光检立测器，激发波长280nm发射波长的450nm方色谱柱：C18（2.1mm×50mm，1.8法µm），流动相A：乙腈，B：含阳性样品UPLC0.1%甲酸的甲酸铵溶液，流速：93%～129%0.19～0.41确证-MS/0.5mL/min，采用梯度洗脱方式，µg/kgMSESI离子源，毛细管电压∶3000-3500kV，干燥气温度：300℃，载气：N2《食HPLC-MS/MS分析测定，色谱柱：现品安C18（150mm×2mm，3µm），流低于有全标动相A：甲醇，B：0.1%甲酸水溶70%～117%1µg/kg/国准蜂液，流速：0.2mL/min，采用梯度家蜜》洗脱方式，ESI离子源，毛细管电标(GB/T压∶4100V，干燥气温度：准4963-2300℃，载气：N2011)59 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文参考文献[1]蒋慧.论我国食品安全监管的症结和出路[J].西北政法大学学报，2011，12（6）：154-162.[2]朱梦蓉，朱昌蕙.我国药品安全监管现状与模式创新路径[J].西南民族大学学报（人文社科版），2009，30（8）：202-205.[3]李海金.食品安全存在的问题分析与对策思考[J].中国药事，2006，20（11）：643-645.[4]闫梦菲.畜产品安全生产与生态畜牧业发展浅谈[J].中国牧业通讯，2011，7（8）：40.[5]陈君石.食品安全-中国的重大公共卫生问题[J].中华流行病学杂志，2003，24（8）：649-650.[6]侯海锋，李茜，郑长山.动物源性食品安全与对策[J].黑龙江畜牧兽医，2012，28（4）：74-75.[7]文利侠，李舒强.动物源性食品安全问题与对策[J].畜牧兽医杂志，2013，1（32）：69-71.[8]刁青云，王允中，黄宇，等.世界主要生产国蜂蜜出口国际竞争力比较分析[J].世界农业，2011（10）：16-18.[9]高芸.中国蜂蜜贸易研究与趋势预测[J].中国蜂业，2012（12）：44-46.[10]TheEuropeanParliamentandtheCouncil.COUNCILDIRECTIVE2002/99/ECof16December2002layingdowntheanimalhealthrulesgoverningtheproductionprocessingdistributionandintroductionofproductsofanimaloriginforhumanconsumption[Z].OfficialJournaloftheEuropeanCommunities，2003，L18：11.[11]朱俊波．我国蜂蜜出口贸易中的技术性贸易壁垒及其影响分析[D].江南大学，2008：15.[12]TheEuropeanParliamentandtheCouncil.COUNCILDIRECTIVE2001/110/ECof20December2001relatingtohoney[z].OfficialJournaloftheEuropeanCommunities,2002,L10:47.[13]陈明，魏瑞成.市售蜂蜜产品中抗生素残留问题[J].蜜蜂杂志，2012，2（2）：11-12.[14]蔡飞，缪海均，刘皋林.第4代喹诺酮类抗菌药物的不良反应及药物相互作用[J].中国临床药学杂志，2003，12（2）：111-113.[15]邱银生，吴佳.动物专用氟喹诺酮类药物研究进展简介[J].中国兽药杂志，1998，32（3）：46-48.[16]WorldHealthOrganization.Evaluationofcertainveterinarydrugresiduesinfood:Forty-eighthreportoftheJointFAO/WHOExpertCommitteeonFoodAdditives[R].Geneva:WHO,1998.[17]曲芬.喹诺酮类药物的软骨毒性[J].国外医药抗生素分册，1998，19（1）：61-64.60 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贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文综述：蜂蜜中喹诺酮类药物残留检测方法的研究进展杨微微综述许乾丽审校1氟喹诺酮的概述1.1氟喹诺酮的定义、分类喹诺酮类抗菌素是一类全人工合成的抗菌药物，自从1962年萘啶酸问世以来，得以合成的喹诺酮类化合物已有数以千计，至今，上市的喹诺酮类药物达几十种。诺氟沙星(Norfloxacin氟哌酸)是第一个氟喹诺酮类药于1979年合成。氟喹诺酮类抗生素(Fluoroquinoloneantibiotics，FQs)属于第三代喹诺酮药是4-Quinolone结构改造衍生物，其共同特点是喹啉环(个别为萘啶环)的C-6位上有氟原子，C-7位上连接哌嗪基或吡咯基，亦称6-氟喹诺酮。在6位上加上一个氟(F)后，增加了脂溶性增强了对组织细胞的穿透力，因而吸收好，组织浓度高，半衰[1-3]期长，更大大增加了抗菌谱和杀菌效果。氟喹诺酮类对G-杆菌，包括绿脓杆菌均有良好抗菌作用，对G+球菌如金黄色葡萄球菌也具一定抗菌活性，尤其对耐药G-杆菌，仍可呈现敏感。由于其宽广的抗菌谱、良好的药动学性质、高效低毒等特点使喹诺酮类抗菌素成为了临床以[4-5]及畜牧业应用最为广泛的抗菌药物之一。目前临床上常用氟喹诺酮类药物主要有诺氟沙星、恩诺沙星、依诺沙星(Enoxacin氟啶酸)、氧氟沙星(Ofloxacin氟嗪酸)和环丙沙星(Ciprofloxacin环丙氟哌酸)。其中环丙沙星被广泛用于防治畜禽疾[6]病，恩诺沙星为人工合成的动物专用药。近年来，由于构效关系的研究进一步展开，不断有氟喹诺酮类新品种研制并上市，氟喹诺酮类药物的发展如雨后春笋，成为抗菌药中一个十分活跃的研究领域。1.2氟喹诺酮的危害大量的科学研究报告表明，氟喹诺酮类药物常见胃肠道紊乱、皮肤反应、中枢神经系统反应和药物相互作用等方面的不良反应。尽管其程度轻微且具有可逆性，但某些品种因上市后经大规模使用逐渐出现严重的毒副作用而被严格限制使用或撤出市场。近年来由于人们不合理使用、滥用以及不遵守此类药物休药期等原因致使生物体耐药性的产生和动物源性食品中氟喹诺酮类药物残留日趋严63 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文重，一方面，动物源性食品中残留的氟喹诺酮会转移到人体，严重危害人体健康，另一方面，动物、禽类产生的耐药菌也会传播给人类扩大了抗生素的副作用。由于致病菌产生的耐药性和某些FQs的潜在致癌性质，氟喹诺酮类药物残留危害性[7-12]问题已然社会各界的高度重视。1.3国内外对氟喹诺酮类残留的规定目前，有近10种氟喹诺酮类药物应用于畜、禽、水产养殖业，而氟喹诺酮类残留的检测方法的食品检测国家标准还不够完善，为保障人民身体健康，完善食品药品质量安全监管体系，防止氟喹诺酮类药物的残留造成更为严重的危害。[13]各国政府和组织都纷纷制定出喹诺酮在动物源性食品中的限量。欧盟委员会制定共同体程序的理事会（EEC)于1999年3月4日对有关确定动物源性食品中[13]兽药最大残留限量NO2377/90法规的附录Ⅰ到Ⅵ进行了修改。1999年3月公布的NO508/1999号法规中对牛奶中的单诺沙星、氟甲喹、麻保沙星、恩诺沙星、和环丙沙星的最高残留限量作了规定。欧盟规定在动物肌肉、肝脏和肾脏中达氟沙星、双氟沙星、恩诺沙星、麻保沙星、沙拉沙星等喹诺酮类兽药最高残留限量0.01～1.9mg/kg，美国FDA规定了出口美国水产品氟喹诺酮类残留量为5μg/kg；日本对进口生鳗鱼及其制品氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星残留量检测，并且将限量控制在0.05mg/kg。2002年我国农业部《动物性食品中兽药最高残留限量》235号公告中规定了不同动物源性食品靶组织（肉、蛋和奶等）中喹诺酮的最高残留限量：恶硅酸（50～150μg/kg）；氟甲喹（50～3000μg/kg）；恩诺沙星（100～300μg/kg）；沙拉沙星（10～80μg/kg）；双氟沙星（100～1900μg/kg）；达氟沙星（30～400μg/kg）；单诺沙星（50～400μg/kg）；但对其他氟喹诺酮类药物残留未有最高残留限量要求。1.4动物源性食品蜂蜜中氟喹诺酮类药物残留的研究状况蜂蜜中的抗生素残留有以下几种来源：（1）本身带有抗生素类杀虫杀菌剂（如农用链霉素等）残留的花蜜和花粉被蜜蜂采集回巢，这些原材料又被蜜蜂加工成蜂粮和蜂蜜，造成了抗生素在蜂蜜中的最初污染。（2）蜂农将抗生素（如四环素类）作为添加剂溶解在糖水里饲喂给蜂群防病治病，这些糖水的一部分残留在蜜蜂的体内，这些体内富集了抗生素的新生代工蜂直接加工蜂蜜，引发抗生素的垂直传递污染；一部分被蜜蜂贮存在巢房里进而造成抗生素在蜂蜜中的残留；（3）64 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文制造商或销售商用抗生素作为保鲜剂添加到蜂花粉产品中，蜂农购买后将它们作为蛋白质饲料给正在养育幼虫的蜂群，于是带有抗生素的花粉粒随着蜜蜂酿蜜掺杂到蜂蜜里，这些就促成了抗生素的水平污染。（4）巢脾和蜜桶清洁不当、蜂群[14-17]间随意调用、旧脾回收重塑等导致抗生素的交叉传递污染。通常蜂蜜中的抗生素残留很低，大众食用后发生急性中毒的可能性极小，所以相比于与当下的“糖浆蜜”、“指标蜜”等假蜜，蜂蜜的抗生素残留是否超标，受到国人的关注度并不那么高。但是，国外发达国家比较注重抗生素残留这个问题。因为长期摄入低抗生素残留的产品会产生积蓄性毒性，无论人还是蜜蜂，都会引[18][19]起体内外菌群失调危害人体健康。2013年陈明、王冉等在《市售蜂蜜产品中抗生素残留问题》的实验研究报告中指出，在对包括安徽、河南、云南、上海、福建、浙江、江西、湖北、北京、广东、广西、四川、吉林、山东和江苏等16个地区的70余家厂家的100份产品进行分析时发现氯霉素药物残留检出率为7%氟喹诺酮类药物的检出率为50%，其中诺氟沙星和环丙沙星残留检出最多分别为44%、33%。尽管这只是一次小小的调查但也反映出当前蜂蜜中氟喹诺酮类药物的残留问题是相当严峻。我国是世界养蜂大国，随着养蜂业产业化的发展，中国蜂蜜产量和出口量一直位居世界前列。近年来，我国蜂蜜产量保持在30万吨左右，约20%～25%出口。1999年至2011年间蜂蜜产量年均增长率约为4.6%，远高于同期世界蜂蜜产量2%。欧盟是世界上重要的蜂蜜进口地区，2009年其进口蜂蜜占世界蜂蜜总进口量的31%，居世界第一。但受2002年氯霉素残留、2008年红霉素超标等抗生素方面的影响使得欧盟禁止进口我国蜂产品，而其他国家在中国的蜂蜜进口量出[20-23]现大幅波动。2011年4月20日，卫生部发布了《食品安全标准蜂蜜》（GB/T14963-2011，该标准为我国唯一的《蜂蜜》强制性国家标准，规定农药残留限量[24-25]应符合GB/T2763及相关规定。因为蜂蜜中氟喹诺酮类药物残留目前尚未有最高限量要求所以导致对其监管上存在诸多漏洞，因此建立全面有效的抗生素监管体系对于我国蜂蜜出口贸易及人民身体健康迫在眉睫。2.动物源性食品蜂蜜中氟喹诺酮类药物残留检测方法研究现状研究报道对于蜂蜜中氟喹诺酮类药物的检测，主要方法有微生物法主要有微生物抑制法、薄层色谱法、毛细管电泳法、高效液相色谱法、液相色谱质谱联用65 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文[26-28]法等。目前我国采用GB/T23412-2009《蜂蜜中19种喹诺酮类药物残留的测[29]定》方法为液相色谱-串联质谱。2.1微生物法1932年，弗莱明在研究溶菌酶和青霉素时，开始使用微生物法测定抗生素的活性。微生物法是在规定条件下选用适当微生物测定某物质含量的方法，被测定的物质可以是生物生长所必需的维生素、氨基酸也可以是抑制某些微生物生长的抗生素、农药等。微生物测定法快速、简便在医药、食品等工业中广泛应用。在[30]2005年黄晓荣等介绍了一种采用EcoliATCC8739为检测菌，检测鳗鱼中喹诺酮类药物残留的微生物抑制实验方法。但该方法的检测低限较高，环丙沙星20[31]g/kg、恩诺沙星25g/kg其它喹诺酮类药物50～250g/kg。沈翠香等建立了一种基于显色反应来定性判断动物源性食品中的恩诺沙星药物残留的微生物检测方法。在培养基中添加适量已知浓度的恩诺沙星来提高敏感菌的敏感度协同显色剂来检测动物源性食品中的恩诺沙星残留该方法检测限低至10µg/kg。庄明[32]亮等将不同剂量的环丙沙星混合于蜂蜜样本中，用氯化三苯基四氮唑作为指示剂，在分别加入了来源于酸牛奶、淤泥土和馊米饭中培养产生的嗜热链球菌之后，环丙沙星在蜂蜜中的最低可检测量为20mg/kg。2.2薄层色谱法薄层色谱法（TLC）是将固定相或支持剂均匀的铺在玻璃板或其它支持物上，以适宜的溶剂作为展开剂，将样品进行分离以定性和定量的一种层析分离技术。具有适用范围广、样品前处理简单、操作简便、设备仪器价格低廉、分析速度快等优点。多被基层单位用于中药材品种的真伪鉴别、中药资源调查和品质的评价、中药及其制剂的质量标准的研究和中药安全性检测等方面。因为薄层色谱对被分离物质具有适用范围广，并且可同时进行多个样品的分离，重复性强，又由于吸附剂的高效化、定量分析的仪器化和自动化，提高了薄层色谱的分辨率及重现性[33]。所以，近几年薄层色谱法在动物源性食品药物残留检测中的运用越来越广泛。[34]田勇等建立了毗呢酸、诺氟沙星、环丙沙星、氧氟沙星4种喹诺酮类药物薄层色谱法分离鉴别方法。所选用的薄层板为硅胶G板，展开剂为氯仿一甲醇一氨水(20∶10∶3)。在356nm的紫外灯下检视4种喹诺酮的斑点Rf值均符合要求。66 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文[35]苏梅用氯仿一甲醇一氨水(15∶10∶3)为展开剂，建立了鉴别中药制剂中添加[36]喹诺酮类药物的薄层色谱方法。钱丽华等以硅胶GF254为固定相，乙酸乙酯一甲醇一浓氨溶液(5∶6∶2)为展开剂，建立了喹诺酮类抗菌药的快速薄层色谱鉴别方法。在此方法下各类喹诺酮类抗菌药具有不同的Rf值，能进行较好的区别。[37][38]王瑞忠等将薄层色谱法用于蜂蜜的真伪鉴别。陈曦等综述了动物性食品中抗生素残留微生物法数种方法，分别为荷兰的肾试验法、德国的三碟法、欧盟的四碟法、七碟法、TTC法等。2.3毛细管电泳法毛细管电泳法是以弹性石英毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，根据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的分析方法。作为一种新发展起来的技术，常用的药物残留检测手段。近年来，运用毛细管电泳法检[39]测动物性食品中氟喹诺酮类药物残留的报道较多。陈天豹等用毛细管电泳法对5种常用的抗生素进行分离时发现加入体积分数为4%的N甲基吗啡啉可大大改善分离效果。该方法具有操作简单、重现性、灵敏度及自动化程度高好等优点，[40]成功地应用于蜂蜜中残留抗生素残留的测定。周梅仙等建立了检测鸡蛋中环丙沙星、氧氟沙星和恩诺沙星3种喹诺酮类抗生素的高效毛细管电泳分析方法。最佳电泳条件为pH8.53的30mmol/LNa2B4O7－10mmol/LKH2PO4缓冲溶液，分离电压18KV，温度25℃。在此条件下，3种抗生素在12分钟内实现基线分离，2各组分质量浓度与峰面积呈良好的线性关系（r＞0.9969），相对标准偏差(RSD)小于3%，平均加标回收率为115.92％～131.77％。2.4高效液相色谱法高效液相色谱法是采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法。该方法具有具有快速、灵敏度高、重现性好、准确度高等特点。目前利用液相色谱法对氟喹诺酮类药物进行测定的报道也很多。食品安全国家标准GB/T29692-2013《牛奶中喹诺酮类药物多残留的测定》即采用高效液相色谱法。环丙沙星、恩诺沙星、沙拉沙星和二氟沙星的检测限为5[41]μg/kg；达氟沙星的检测限为1μg/kg。魏贞贞等对HPLC内标法测定蜂蜜中抗生素进行了研究建立了检测蜂蜜中三种抗生素的内标定量方法。该方法在10～200μg/kg内线性关系良好，加标回收率为82.4%～93.7%，可用于蜂蜜中三种抗生67 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文[42]素的微量检测。卢坤等应用高效液相色谱法同时测定蜂蜜中喹诺酮类、磺胺类、氯霉素类、硝基咪唑类、四环素类5类共15种抗生素残留量。经pH2.0的磷酸水溶液溶解蜂蜜后直接用PCX固相萃取小柱净化富集，以乙腈-磷酸溶液(pH2.5)作流动相，紫外检测器检测。该方法的检出限为9.70～12.54μg/kg。2.5高效液相色谱质谱联用法液质联用技术是以液相色谱作为分离系统，质谱作为检测系统，样品在液相色谱和质谱部分经过分离和离子源中离子化，然后分析真空环境中离子的移动，通过控制离子从质量分析器到达检测器的运动而转化成实际信号来达到检测的目的。结合色谱对复杂样品的高分离能力和质谱的高选择性、高灵敏度及能够提供相对分子量和结构信息等优点，高效液相色谱谱质谱联用法在药物分析、食品质量安全检测等领域得到广泛应用。高效液相色谱串联三重四极杆质谱(UPLC-MS/MS)以及气相色谱-质谱(GC-MS)是目前最常见的质谱联用仪。三重四极杆包括三组四根平行的双曲线杆，平行杆上通有直流和交流电压，可通过它来筛选出特定的离子，充分将色谱的分离功能和质谱的确证能力结合起来，不仅具有很好的定量分析能力上在灵敏度和选择性方面也非常突出，在微量的药物残留[43]分析中发挥着不可替代的作用。对于蜂蜜中氟喹诺酮类药物残留的检测，我国目前采用食品安全国家标准GB/T23412-2009《蜂蜜中19种喹诺酮类药物残留的测定》中规定的液相色谱-串联质谱，该方法19种喹诺酮检出限均为1μg/kg与欧盟、美国和日本等目前采[44]用的检出方法检出限基本相同。丁涛等建立了高效液相色谱-电喷雾串联质谱联用测定蜂蜜中残留的恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星等19种喹诺酮类药物。线性范围为1～100μg/L，方法的定量限(S/N=10)1.0μg/kg，回收率为71%～[45]118%，相对标准偏差4.2%～6.7%。何强等采用多重反应监测建立了蜂蜜样品中15种喹诺酮类兽药残留的超高效液相色谱-串联质谱的检测方法。检出限均低于或等于1.0ng/mL，回收率均在78.6%～112.9%范围内，相对标准偏差均在10%范围内。该方法灵敏度高、选择性好各项指标均能满足国内外各项法规的要求。[46]王伟等利用液质联用技术建立了同时测定蜂蜜中60种兽药残留的LC-MS/MS检测方法。60种兽药平均回收率在70%～120%范围内，RSD为0.6%～20%，检68 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文出0.01～17.99μg/kg。该方法可同时测定60种兽药残留适合于蜂蜜中多类兽药的高通量筛查检测。3.动物源性食品蜂蜜中氟喹诺酮类药物残留检测发展趋势及展望尽管目前对于氟喹诺酮类药物残留检测的方法较多，但就蜂蜜中氟喹诺酮类药物残留检测技术还有待提高结合当前检测技术的优缺点和研究现状来看，未来动物源性食品蜂蜜中氟喹诺酮类药物处理检测方法大体有3个发展趋势：（1）优化前处理方法，尽可能的出去供试品中的杂质，减小杂质对仪器造成的污染。提高样品的回收率，对于检测动物源性食品中微量的药物残留，回收率不好是一直存在的难题，优化前处理方法是解决这一难题有效途径。（2）降低检出限，高效液相色谱法与质谱联用法检出限较低可所需仪器设备较为昂贵，很多基层单位无法满足条件；薄层色谱法无需高档仪器可方法检出限较高。根据实际情况，研究不同检测方法以满足对药物残留检出限低的要求。（3）向多组分同时测定方向发展，氟喹诺酮类药物是合成抗菌药，具有相同的母核且结构相似加大了对其同时检测的难度。未来应逐步完善检测方法，同时多种氟喹诺酮类药物。69 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贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文作者简历姓名：杨微微性别：女出生年月：1988年9月民族：汉籍贯：贵州政治面貌：中共党员一、简要学历及工作经历2008年9月-2012年6月贵阳医学院药学专业，医学学士；2012年9月-2015年6月贵阳医学院攻读医学硕士学位（推免）。二、攻读学位期间参加的科研项目1.国家局餐饮服务食品安全标准制定项目，餐饮服务食品色素检测研究2.贵州省科技计划黔科合SY字[2012]3061号，贵州动物源性食品氟喹诺酮类药物残留及快速筛查技术研究。三、攻读学位期间获奖情况1.2011年5月获2010-2011学年国家励志奖学金；2.2009年5月获优秀学生干部。四、攻读学位期间发表的学术论文（一）已发表论文1.杨微微，许乾丽，王俪瓯等.高效液相色谱法测定面条中柠檬黄、日落黄含量的不确定度分析[J].食品安全质量检测学报.2014，5(7)：2208-2214.2.杨微微，杨勇，罗曼等.QuEChERS—液相色谱法同时测定蜂蜜中6种氟喹诺酮类药物残留[J].贵州农业科学，2015，43（2）：165-169.73 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文致谢从课题开始到毕业论文的顺利完成，太多可敬的师长、同学、朋友给了我莫大的帮助，在这里请接受我诚挚的谢意。首先向我的导师郝小燕教授、许乾丽主任药师表示由衷感谢，感谢你们给我了我三年研究生学习的机会。感谢许乾丽老师和茅向军老师对本论文的精心设计和悉心指导，两位老师在论文的总体设计、整体实验方案的研究及文章的审阅方面均倾注了大量的心血。老师严谨的科学态度、精益求精的工作作风以及不断专研的学者精神都都是我学习的典范，他们不仅授我以文还言传身教，教会了我许多为人处事的道理，使我在今后的旅途中受益终生。本论文是在贵州省食品药品检验所完成，感谢所有关心、支持和帮助过我的领导、同事。特别要感谢贵州省食品药品检验所抗生素室罗曼老师，食品室张炯仪、王勇、杨园园、王本江等老师在实验中给予我的极大帮助。真诚感谢我的各位师兄、师姐、师弟、师妹、同学和朋友。三年来在我学习和生活上给予的莫大帮助。最后，感谢我的父母，感谢你们给予我的物质和精神上的支持，今后我将以我的行动予以回报。74 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文学位论文数据集关键词*密级*中图分类号*UDC论文资助蜂蜜；氟喹诺酮；薄层色谱；公开R917615.2贵州省科技高效液相色谱；质谱；计划学位授予单位名称*学位授予单位代码*学位类别*学位级别*贵阳医学院10660科学学位硕士论文题名*论文语种*动物源性食品蜂蜜中六种氟喹诺酮药物残留检测方法研究中文并列题名*Studyondetectionmethodsofsixkindsofanimaloriginfluoroquinoloneresiduesinhoneyproduct作者姓名*杨微微学号*10660S120136培养单位名称*培养单位代码*培养单位地址邮编贵阳医学院10660贵阳市云岩区北京路550004学科专业*研究方向*学制*学位授予年*药物分析药品质量控制关键技术研究全日制2015年药品检验论文提交日期*2015年5月导师姓名*许乾丽职称*主任药师评阅人答辩委员会主席*答辩委员会成员盲评刘建华席晓岚、鲍家科、茅向军、高秀丽电子版论文提交格式文本（√）图像（）视频（）音频（）多媒体（）其它（）推荐格式：application/msword；application/pdf电子版论文出版（发布）者电子版论文出版（发布）地权限声明论文总页数*85页共33项，其中带*为必填数据，为22项。75