红肉蜜柚及其亲本琯溪蜜柚psy基因的分离 57页

本科生毕业设计（论文）题目：红肉蜜柚及其亲本琯溪蜜柚PSY基因的分离学院：化学与生命科学学院 毕业设计（论文）原创性声明和使用授权说明原创性声明本人郑重承诺：所呈交的毕业设计（论文），是我个人在指导教师的指导下进行的研究工作及取得的成果。尽我所知，除文中特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或组织已经发表或公布过的研究成果，也不包含我为获得及其它教育机构的学位或学历而使用过的材料。对本研究提供过帮助和做出过贡献的个人或集体，均已在文中作了明确的说明并表示了谢意。作者签名：　　　　　日　期：　　　　　指导教师签名：　　　　　日　　期：　　　　　使用授权说明本人完全了解大学关于收集、保存、使用毕业设计（论文）的规定，即：按照学校要求提交毕业设计（论文）的印刷本和电子版本；学校有权保存毕业设计（论文）的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务；学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文；在不以赢利为目的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。作者签名：　　　　　日　期：　　　　　 目录摘要1英文摘要11引言12材料22.1植物材料22.2实验试剂22.3主要仪器和设备23方法33.1总RNA提取33.1.1常用试剂配制33.1.2器具处理与准备33.1.3提取RNA33.2RNA的纯化43.3RNA提取质量与含量检测43.3.1总RNA的电泳分析43.3.2总RNA含量与纯度测定43.4cDNA链合成53.4.1cDNA一链的合成53.4.2cDNA第二链合成53.5基因的克隆及序列分析63.5.1基因的克隆63.5.2割胶回收63.5.3T-载体连接64结果与分析74.1RNA电泳结果分析74.2RNA紫外分光光度计测定结果分析74.3纯化后RNA电泳结果分析84.4合成cDNA电泳结果分析84.5PSY基因的克隆94.6序列性分析95讨论12参考文献14致谢词16红肉蜜柚及其亲本琯溪蜜柚PSY基因的分离化学与生命科学学院生物科学专业付文佳（05260204）指导老师：杨莉（副教授） 摘要：采用改良Bugos法提取红肉蜜柚及其亲本琯溪蜜柚成熟果实果肉RNA，逆转录合成cDNA。根据NCBI网站公布的PSY基因全序列设计引物，采用高保真Taq聚合酶进行PCR扩增，将扩增产物连接到pUCm-T载体，转化至大肠杆菌DH5α，并送公司测序。比较发现，红肉蜜柚和琯溪蜜柚果肉PSY基因全长均为1317bp，编码439个氨基酸，序列比对结果显示两者PSY基因与柑桔属PSY基因同源性都相对较高，同源性最高达99%。关键词：红肉蜜柚；琯溪蜜柚；PSY基因；基因分离；序列分析IsolatingPSYGenefromRed-fleshedSweetPomeloandItsParentGuanxiSweetPummeloFUWen-jiaDirector:YANGLi(CollegeofChemistryandLifeScience,ZhejiangNormalUniversity,052No.04)Abstract：ThetotalRNAwasextractedfromtheripefruitofRed-fleshedsweetpomeloandGuanxisweetpomelousingimprovedBugosRNAextractionmethod,thenweresynthesisedcDNAbyreversetranscriptasekit.Atthesametime,wedesignedprimersforPSYgenesequencesaccordingtotheinformationPSYgenesequencesonNCBI,high-fidelityTaqpolymerasewereusedforPCRamplificationandcDNAasthetemplate.Finally,thePCRproductswereconnectedtopUCm-Tvector,thensequencedandanalyzedthesequences.SequenceanalysisindicatedthatthecDNAfragmentwas1317bp,encodinga439aminoacidproteinandhaved99%identitywiththoseofothercitrusinthehighestlevel.TheresearchingmaybeessentialforthemolecμLarmechanismofPSYgenemutation.KeyWords：red-fleshedsweetpomelo;guanxisweetpummelo;PSYgene;geneisolationing;sequenceanalysis1引言芽变是体细胞突变的一种，即突变发生在芽分生组织细胞中，当芽萌发长成枝条，表现出与原来植株不同的性状即为芽变，经突变的芽长成枝条经繁育可成为变异单株，是果树等多年生作物的一种特殊育种途径[1]。红肉蜜柚源自琯溪蜜柚芽变，是平和县小溪镇厝丘村果农林金山于1988年在自家果园发现的优良芽变株[2]。之后，由福建省农科院果树研究所及平和县农业局等组成课题组，进行新品种的选育、保护和繁殖工作。经专家3年实地跟踪验证，认为该品种具备新颖性、特异性、一致性和稳定性，并于2006年正式通过了专家组的品种认定，正式命名红肉蜜柚[3] 。经检测：红肉蜜柚的微量元素比野生型琯溪蜜柚含量更丰富，所含的黄酮类和类胡萝卜素共同具有抗癌作用，比其它柚类更具防心脏病，降血脂功效。红肉蜜柚也是目前国内外已选育出的红肉类型柚中果形最大，品质最优，成熟期早呈色最红、有益天然色素含量最高的品种，其开发前境较大。近年来，越来越多的医学研究表明，除了不少类胡萝卜素代谢中间产物是维生素A的前体外，在猝灭自由基、增强人体免疫力、预防心血管疾病和防癌抗癌等保护人类健康方面也起着十分重要的作用[4]。因此类胡萝卜素既是影响果实外观品质和花卉观赏价值的重要因素，也是决定水果、蔬菜内在营养品质的重要指标。了解植物类胡萝卜素积累的特点与代谢的生理机制，对于进一步调控植物类胡萝卜素的生物合成途径具有重要的意义。类胡萝卜素生物合成的第一步是由八氢番茄红素合成酶[5~7]。在番茄和油菜等植物中，PSY被证实是类胡萝卜素生物合成的关键调节酶之一。因此，PSY基因是应用植物基因工程改善转基因植物中类胡萝卜素含量的首选目的基因。此外，该基因在成熟叶片中的表达高于幼叶[8]。前人在温州蜜柑果实发育过程中的研究，已经明确在b-隐黄质的积累起关键作用的主要是位于类胡萝卜素生物合成途径上游的PSY基因，而非下游的BCH基因[9]。本实验拟分离红肉蜜柚及其亲本琯溪蜜柚果实PSY基因全长，比较分析二者序列是否存在差异，以了解PSY基因在突变体中的具体功能，为解释红肉蜜柚发生变异的分子机制提供理论基础。2材料2.1植物材料成熟红肉蜜柚及其亲本琯溪蜜柚果实由福建省农科院提供。2.2实验试剂试剂Tris-HCl，EDTA，SDS购自北京博大泰克生物有限公司，b-巯基乙醇，DEPC（焦碳酸二乙酯），Tris饱和酚，LiCl购自北京鼎国生物有限公司，内切酶、连接酶，pUCm-T，DNaseI载体购自宝生物工程（大连）有限公司，高保真TaqDNA聚合酶购自北京全式金生物技术有限公司，逆转录酶购自Promega生物技术有限公司，实验中涉及的引物由上海赛百盛生物有限公司合成，其他试剂均为国产分析纯。2.3主要仪器和设备高速台式冷冻离心机，电泳仪，电热恒温水浴锅，PCR仪，烘箱等。3方法3.1总RNA提取3.1.1常用试剂配制①0.1%DEPC溶液：在经高温烘烤4h除RNA酶的试剂瓶中用ddH2 O配制成0.1%DEPC溶液，37℃放置12h以上，120℃高压灭菌30min；②2MNaCl：11.688gNaCl溶于100mLDEPC处理的ddH2O，120℃高压灭菌30min；③0.5MEDTA：9.306gEDTA溶于50mLDEPCddH2O，用氢氧化钠固体调节pH至9.0，120℃高压灭菌30min；④12MLiCl：144.98gLiCl加热溶解于200mLDEPCddH2O，120℃高压灭菌30min；⑤0.1MTris-HCl：12.11gTris-HCl溶于灭菌过的DEPCddH2O，用浓HCl调节pH至9.0；⑥3MNaAc：12.3045gNaAc溶于30mLDEPCddH2O，加冰乙酸调节pH至5.2，定容至50mL，120℃高压灭菌30min。⑦70%乙醇：取30mL的DEPCddH2O至70mL无水乙醇中（DEPCddH2O需先高压灭菌处理）。3.1.2器具处理与准备①塑料制品（包括枪头、EP管等）：用DEPCddH2O浸泡枪头、EP管，37℃放置过夜，121℃高压灭菌30min，65℃烘干备用；②玻璃制品：清洗干净，0.1%DEPCddH2O处理，65℃烘烤4h。③研钵：清洗干净，用锡泊纸包裹，180℃烘烤6~8h。3.1.3提取RNA参照徐昌杰等建立的适于柑橘果实RNA的改良Bugos方法提取成熟红肉蜜柚及其亲本琯溪蜜柚果肉总RNA[10,11]。①取3.5mL提取液（提取液配方为0.1MTris，0.2MNaCl，15mMEDTA，0.5%SDS，1%b-巯基乙醇，pH9.0），加1g果肉（液氮研磨），混匀，室温放置5min，加入1.5mLTris饱和酚，混匀，室温放置3min；②加入0.7mL氯仿，混匀，室温放置3min；③加入0.28mLNaAc，混匀，冰上放置15min，4℃，10000rpm离心20min；④上清液转至新的离心管中，加入等体积酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）抽提；⑤上清液转至新的离心管中，加入等体积氯仿/异戊醇（24：1）抽提；⑥上清液移至新的离心管中，加入等体积异丙醇，-70℃沉淀20min；⑦沉淀用1mLDEPCddH2O溶解，加入1/4VLiCl混匀，冰上放置2h（如有不溶杂质，在加LiCl前要离心去除）；⑧4℃，10000rpm离心20min，沉淀用1mLDEPCddH2O溶解，加入1/4 VLiCl混匀，冰上放置2h以上；⑨离心，沉淀用0.6mLDEPCddH2O溶解；加等体积酚/氯仿/异戊醇、氯仿/异戊醇各抽提一次，上清液加入2V无水乙醇，1/10VNaAc，-70℃沉淀20min；⑩离心，沉淀用70%无水乙醇漂洗，室温晾干，最后视沉淀的量加入50~100μLDEPCddH2O溶解。3.2RNA的纯化DNaseI处理：将提取得到的红肉蜜柚及其亲本琯溪蜜柚果肉总RNA，加DEPCddH2O补足到44.5μL，再加入5μL10×反应缓冲液和0.5μLDNaseI，于37℃保温30min。反应结束按如下操作处理：①加DEPCddH2O补足至300μL，加等体积酚/氯仿/异戊醇抽提，离心；②上清液再加等体积氯仿/异戊醇抽提一次；③加入1/10VNaAc，2V无水乙醇，混匀，-70℃沉淀20min；④4℃，12000rpm离心15min；⑤沉淀用70%乙醇漂洗；⑥晾干，溶于20μL的DEPCddH2O。3.3RNA提取质量与含量检测3.3.1总RNA的电泳分析取1μL总RNA样品，稀释10倍，于1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，观察总RNA条带情况，凝胶成像，拍照。3.3.2总RNA含量与纯度测定取1μL总RNA样品，于紫外分光光度计上测OD230，OD260，OD280根据比值分析RNA纯度及含量。3.4cDNA链合成参照PromegaMMLV反转录酶使用说明，所使用引物如下：SMARTOligonucleotide：5"-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG-3"3"SMART™CDSPrimerIIA：5"-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT(30个T碱基)VN-3"(N=A，C，GorT；V=A，GorC)5"PCRPrimerIIA：5"-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3"3.4.1cDNA一链的合成具体操作参见表1-1，表1-2。表1-1cDNA第一链合成红肉蜜柚（μL）琯溪蜜柚（μL） RNA（2ug）3.513"SMARTCDSprimer5"A(10uM)0.50.5SMARTOligo(10uM)0.50.5ddH2O12.4514.75表1-1cDNA第一链合成70℃温育5min后，立即转到冰上放置5min；表1-2cDNA第一链合成红肉蜜柚（μL）琯溪蜜柚（μL）5×RTBuffer555"PCRPrimerIIA(10uM)1.251.25RNAinhibitor11M-MLV 1142℃温育60min，转至72℃温育10min后，放置冰上保存。3.4.2cDNA第二链合成反应体系及程序如下：表1-3cDNA第二链合成红肉蜜柚（μL）琯溪蜜柚（μL）10×PCRBuffer55dNTPs1.51.5TaqDNA聚合酶11模板cDNA33ddH2O38.538.5total5050PCR循环条件：95℃预变性1min后，95℃15s，65℃30s，68℃6min，28个循环，68℃延伸7min，4℃保存。3.5基因的克隆及序列分析3.5.1基因的克隆以成熟红肉蜜柚和琯溪蜜柚果实cDNA为模板，以上游引物5’-ATGTCTGTTACATTGCTGTGGG-3’和下游引物5’-TTAAGCCTTACTGGTATATATTCTTG-3’，PCR扩增程序如表1-4。表1-4PSY基因PCR扩增体系红肉蜜柚（μL）琯溪蜜柚（μL） ddH2O19.719.710×PCRBuffer(含Mg2+)2.52.5dNTPs0.30.3模板11P130.50.5P140.50.5PfuTaq0.50.5total2525PCR循环条件：94℃预变性4min后，94℃50s，50℃50s，72℃90s，35个循环，72℃延伸10min，5℃保存。3.5.2割胶回收对目的条带进行割胶回收，回收步骤如下：①将PCR产物在1％琼脂糖凝胶上电泳，切下所需DNA条带，将其装入1.5mL离心管；②200~400mg琼脂糖凝胶加入0.4mL纯化树脂，70℃保温5~10min，每2min颠倒混匀一次，使琼脂糖凝胶完全融化；③将混合液用移液器装入离心纯化柱，13000rpm离心30s，倒掉废液；④加入500μL80％乙醇，13000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液；（重复第4步一次，此步骤13000rpm离心2min，务必将乙醇除尽）⑤将纯化柱套入干净1.5mL离心管中，加入25μL超纯水于纯化树脂，70℃水浴2min，13000rpm离心30s；⑥离心管中液体即是纯化DNA片段，取3μL电泳检测并且测定含量。3.5.3T-载体连接、转化按如下反应体系于16℃进行连接反应：pUCm-T0.5μL，DNA连接酶缓冲液1μL，T4DNA连接酶1μL，回收产物7.5μL。回收产物与生工pUCm-T载体进行连接克隆。使用自制DH5α感受态细胞进行转化，涂板于Amp抗生素的LB培养基中过夜培养，挑取单菌落，于含Amp抗生素的液体LB培养基进行培养，提取质粒，链接产物。3.5.4序列测定鉴定后的克隆送至上海英俊生物技术有限公司测序，测序结果提交到NCBI中核酸数据库做BLAST同源性检索，并利用ClustalX软件对所得序列进行分析。4结果与分析4.1RNA电泳结果分析 RNA样品的凝胶电泳分析是判断RNA质量的一种重要手段，从电泳胶上28SrRNA和18SrRNA的完整性可以判断RNA有无降解及降解程度，也可以判断有无DNA污染。　　　1　　　2采用改良Bugos法提取红肉蜜柚突变体及其亲本琯溪蜜柚果实总RNA，色泽白，较为透明，易于溶解。样品经电泳检测表明，提取出总RNA能清楚地看到28SrRNA和18SrRNA两条RNA条带，提取的RNA完整，没有发生降解。图1-1果肉RNA琼脂糖凝胶电泳图谱注：1.红肉蜜柚；2.琯溪蜜柚4.2RNA紫外分光光度计测定结果分析一般情况下，紫外测定结果OD260/OD280比值为1.7-2.0，OD260/OD230比值大于2.0时认为获得的RNA样品较纯净。当OD260/OD280比值小于1.7时，可能有蛋白表1-5总RNA比色测定结果紫外比色及比值样品名称红肉蜜柚琯溪蜜柚RNA的含量564.0ng/μL1959.8ng/μLOD260/OD2802.002.11OD260/OD2302.222.24质污染；OD260/OD230比值小于2.0时，RNA样品可能还有其它如酚类化合物的干扰物存在[12]。从表1-5测定结果可以看出，OD260/OD230的吸光度比值大于2.0，说明没有多糖、盐或其他杂质的重大污染。OD260/OD280处的吸光度比值接近2.0，说明也没有蛋白质的重大污染，故用此法所提总RNA纯度较好，所以进行后续试验。4.3纯化后的RNA电泳结果分析 采用改良Bugos法提取所得RNA存在一定的DNA污染，因而应用这些样品进行RT-PCR或其它操作前应先用Dnase去除DNA，或对本方法所得RNA进行再次LiCl沉淀以进一步去除DNA。从图1-2来看，提取的样品已无DNA的污染。12图1-2果肉RNA纯化后的电泳图谱注：1.红肉蜜柚；2.琯溪蜜柚4.4合成的cDNA电泳结果分析从图1-3来看，合成的cDNA二链呈弥散状，在500~750bp间有特征带的出现，表明该物种果实中大部分基因的长度都在该区间内。12M1231300bp——图1-3cDNA二链电泳图谱注：M.marker；1.红肉蜜柚；2.琯溪蜜柚；3.阴性对照4.5PSY基因的克隆琯溪蜜柚与红肉蜜柚PSYPCR结果显示，两者扩增片段大小相同，均扩增出单一的条带，大约为1300bp，将片段回收，连接至T-载体，转化至大肠杆菌DH5α，经实验室初步验证正确后送上海英杰公司测序。4.6序列性分析将测序结果整理如下（方框内为PCR扩增时所使用引物），测序结果表明，红肉蜜柚和琯溪蜜柚PSYcDNA均长1317bp，与NCBI网站上其他相似序列比对结果发现，该DNA序列包含完整的阅读框，编码423个氨基酸。（1）红肉蜜柚果实PSY基因全序列（红肉蜜柚PSY 基因进行了两次测序，测序结果完全一致）：ATGTCTGTTACATTGCTGTGGGTTGTATCACCTAACTCACAATTGTCCAATTGCTTCGGGTTCGTCGATTCAGTTCGAGAGGAAAACAGGCTGTTTTATTCATCAAGATTTCTTTACCAACATCAAACCCGGACTGCTGTGTTTAATTCTAGACCTAAGCAGTTTAATAATAATAATAATAATAAGCAGAAACGGAATTCTTATCCTTTAGATACAGATTTGAGGCATCCTTGCTCATCTGGAATCGGCTTGCCTGAAATATCATGTATGGTTGCTAGCACTGCTGGAGAAGTGGCCATGTCTTCAGAAGAAATGGTTTACAATGTTGTGCTCAAGCAGGCAGCCTTGGTTAATAAGCAACCAAGTGGGGTTACTCGTGATCTTGATGTGAACCCAGATATTGCTTTACCCGGAACTTTAAGTCTGCTCAGTGAAGCTTATGATCGTTGTGGAGGAGTTTGCGCCGAGTATGCTAAGACATTTTACTTGGGAACTTTGCTGATGACCCCTGAAAGGCGAAGGGCTATATGGGCTATATATGTGTGGTGTAGGAGGACAGATGAGCTCGTTGATGGGCCTAATGCTTCACACATAACTCCAACAGCTTTAGACAGGTGGGAGTCCAGGTTGGAAGACCTTTTCCGGGGTCGTCCATTTGATATGCTTGATGCTGGATTATCAGATACAGTAACCAAATTTCCTGTCGACATTCAGCCATTCAGAGATATGATAGAAGGAATGAGGATGGACCTTAGGAAGTCAAGATACAAAAACTTTGATGAATTATACTTGTATTGTTATTATGTTGCTGGGACCGTAGGGCTAATGAGTGTTCCAGTTATGGGCATAGCACCTGACTCACAGGCAACAACAGAGAGCGTCTACAATGCAGCATTGGCACTAGGGATTGCTAATCAGCTCACTAACATACTCAGAGATGTTGGAGAGGATGCCCAAAGAGGAAGGGTTTATCTACCACAAGATGAGTTGGCATAGGCGGGGCTTTCAGATGATGACATATTTGCTGGAGAAGTGACTAATAAATGGAGAAACCTCATGAAGAACCAAATTAAGAGGGCAAGGATGTTCTTTGATATGGCTGAGAACGGTGTGACCGAGCTGAGTGAAGCTAGTAGATGGCCGGTATGGGCTTCATTGCTGTTGTACCGGCAAATACTGGATGAGATTGAGGCCAATGATTACAACAACTTCACAAAGAGAGCTTATGTGAGTAAGGCCAAGAAGATAGCTGCACTACCAATTGCATATGCAAAATCCCTCTTACGCCCGTCAAGAATATATACCAGTAAGGCTTAA将测序结果在NCBI网站比对，结果如表1-6。表1-6红肉蜜柚果实PSY基因测序结果比对AccessionDescriptionMaxscoreTotalscoreQuerycoverageMaxidentgi|166343817|EU375852.1CitrusmaximaphytoenesynthasemRNA,completecds24482448100%99%gi|82394886|DQ235260.1CitrussinensisphytoenesynthasemRNA,completecds24022402100%98%gi|6959859|AF220218.1Citrusunshiuphytoenesynthase(Psy1)mRNA,completecds24022402100%98%gi|11344506|AB037975.1CitrusunshiumRNAforphytoenesynthase,completecds24022402100%98%续表1-6gi|166343815|EU375851.1XCitrofortunellamitisphytoenesynthasemRNA,completecds23902390100%98% gi|13542331|AF152892.2CitrusxparadisiphytoenesynthasemRNA,completecds23842384100%98%注：Citrusmaxima：文旦；Citrussinensis：甜橙；Citrusunshiu：温州蜜柑；Citrofortunellamitis：四季橘；Citrus×paradisi：葡萄柚通过比对结果发现：①红肉蜜柚果实PSY基因与柑桔属PSY基因同源性都相对较高，其中与柚PSY基因（No.166343817）同源性最高；②与柚PSY基因（No.166343817）比对发现：有一个TAA的gap存在；9个碱基不匹配。（2）野生型琯溪蜜柚PSY基因全序列ATGTCTGTTACATTGCTGTGGGTTGTATCACCTAACTCACAATTGTCCAATTGCTTCGGGTTCGTCGATTCAGTTCGAGAGGAAAACAGGCTGTTTTATTCATCAAGATTTCTTTACCAACATCAAACCCGGACTGCTGTGTTTAATTCTAGACCTAAGCAGTTTAATAATAATAATAATAATAAGCAGAAACGGAATTCTTATCCTTTAGATACAGATTTGAGGCATCCTTGCTCATCTGGAATCGACTTGCCTGAAATATCATGTATGGTTGCTAGCACTGCTGGAGAAGTGGCCATGTCTTCAGAAGAAATGGTTTACAATGTTGTGCTCAAGCAGGCAGCCTTGGTTGATAAGCAACCAAGTGGGGTTACTCGTGATCTTGATGTGAACCCAGATATTGCTTTACCCGGAACTTTAAGTCTGCTCAGTGAAGCTTATGATCGTTGTGGAGAAGTTTGCGCCGAGTATGCTAAGACATTTTACTTGGGAACTTTGCTGATGACCCCTGAAAGGCGAAGGGCTATATGGGCTATATATGTGTGGTGTAGGAGGACAGATGAGCTCGTTGATGGGCCTAATGCTTCACACATAACTCCAACAGCTTTAGACGGGTGGGAGTCCAGGTTGGAAGACCTTTTCCGGGGTCGTCCATTTGATATGCTTGATGCTGGATTATCAGATACAGTAACCAAATTTCCTGTCGACATTCAGCCATTCAGAGATATGATAGAAGGAATGAGGATGGACCTTAGGAAGTCAAGATACAAAAACTTTGATGAATTATACTTGTATTGTTATTATGTTGCTGGGACCGTAGGGCTAATGAGTGTTCCAGTTATGGGCATAGCACCTGACTCACAGGCAACAACAGAGAGCGTCTACAATGCAGCATTGGCACTAAGGATTGCTAATCAGCTCACTAACATACTCAGAGATGTTGGAGAGGATGCCCAAAGAGGAAGGGTATATCTGCCACAAGATGAGTTGGCACAGGCGGGGCTTTCAGATGATGACATATTTGCTGGAGAAGTGACTAATAAATGGAGAAACTTCATGAAGAACCAGATTAAGAGGGCAAGGATGTTCTTTGATATGGCTGAGAACGGTGTGACCGAGCTGAGTGAAGCTAGTAGATGGCCGGTATGGGCTTCATTGCTGTTGTACCGGCAAATACTGGATGAGATTGAGGCCAATGATTACAACAACTTCACAAAGAGAGCTTATGTGAGTAAAGCCAAGAAGATAGCTGCACTACCAATTGCATATGCAAAATCCCTCTTACGCCCGTCAAGAATATATACCAGTAAGGCTTAA将测序结果在NCBI网站比对，结果如表1-7。表1-7琯溪蜜柚果实PSY基因测序结果比对 AccessionDescriptionMaxscoreTotalscoreQuerycoverageMaxidentgi|166343817|EU375852.1CitrusmaximaphytoenesynthasemRNA,completecds24422442100%98%gi|82394886|DQ235260.1CitrussinensisphytoenesynthasemRNA,completecds23962396100%98%gi|6959859|AF220218.1Citrusunshiuphytoenesynthase(Psy1)mRNA,completecds23962396100%98%gi|11344506|AB037975.1CitrusunshiumRNAforphytoenesynthase,completecds23962396100%98%gi|166343815|EU375851.1XCitrofortunellamitisphytoenesynthasemRNA,completecds23842384100%98%gi|13542331|AF152892.2CitrusxparadisiphytoenesynthasemRNA,completecds23792379100%98%注：Citrusmaxima：文旦；Citrussinensis：甜橙；Citrusunshiu：温州蜜柑；Citrofortunellamitis：四季橘；Citrus×paradisi：葡萄柚通过比对可发现：①与柑桔属PSY基因同源性都较高，其中与柚PSY基因（No.166343817）同源性最高；②与柚PSY基因（No.166343817）比对发现：有一个TAA的gap存在；8个碱基不匹配。此外，我们还将红肉蜜柚突变体与野生型琯溪蜜柚果实PSY基因DNA序列和氨基酸序列进行比对分析，发现在1317bp的编码区内出现11个差异位点，439个氨基酸序列中有7个差异位点，出现差异位点表1-8，1-9：表1-8红肉蜜柚和琯溪蜜柚PSY基因序列不一致情况分析样品名称碱基位点248352455613904969975994105410681236红肉蜜柚AGAGAAGGTGA琯溪蜜柚GAGAGTATCAG表1-9红肉蜜柚和琯溪蜜柚PSY基因合成的氨基酸序列不一致情况分析样品名称氨基酸位点83118152205302332352 红肉蜜柚GNGRGZL琯溪蜜柚DDEGRQF5讨论类胡萝卜素是生物体内通过类异戊二烯途径合成而呈现黄色、橙红色和红色的一大类帖类色素物质，类异戊二烯是自然界中分布广泛的一类化合物，目前已知的类异戊二烯化合物有23000多种。所有的光合生物以及许多非光合细菌和真菌均可以在体内合成类胡萝卜素。类胡萝卜素是其中较为重要的植物色素，不仅参与光合作用和光保护，还赋予根、叶、花和果实等多彩的颜色，使之具有较大的经济价值和观赏价值。除此之外，类胡萝卜素中一些代谢中间产物还具有较高的营养和保健价值，如番茄红素能预防心脏病和多种癌症、减缓动脉粥样硬化、保护心血管、抗老化、保护皮肤等；b-胡萝卜素是维生素A原，维生素A缺乏会引起夜盲症等多种疾病的发生。近年来，包括番茄红素和b-胡萝卜素在内的植物类胡萝卜素代谢途径的主要成员、关键酶及其基因已基本明确[13~16]。应用类胡萝卜素合成途径中相关基因的转基因研究也取得了较大进展，“黄金稻米”就是最成功的例子[17]。例如，Ye等[18]与Romer等[19]分别向水稻和番茄中导入类胡萝卜素合成途径相关基因，并未获得预期中高水平的番茄红素积累，却导致靶器官中b-胡萝卜素含量增加。由此可见，为减少类胡萝卜素遗传工程中的盲目性，阐明植物体内类胡萝卜素代谢相关基因表达调控机制十分必要。现有研究表明，类红萝卜素合成途径可包括上游（八氢番茄红素的合成）和下游（类胡萝卜素种类间的转化）途径。研究还表明下有途径的调控通常只能影响类胡萝卜素组成而对总含量影响较小。几乎所有高等植物类胡萝卜素合成主链途径均相同，柑桔类也不例外。类胡萝卜素上游合成途径需要十种酶参与，其活性的高低直接决定了果实类胡萝卜素的含量。在番茄等模式植物上的研究表明，在上述十种酶中以DXPS和PSY最为关键[20~22]。本研究根据GenBank中报道的植物类胡萝卜素代谢相关酶基因序列，分离了红肉蜜柚及其亲本琯溪蜜柚果实PSY基因(八氢番茄红素合成酶基因)。它是催化类胡萝卜素生物合成的一个特异性酶，可以将2分子的磷酸(GGPP)催化合成第一个类胡萝卜素——八氢番茄红素。八氢番茄红素合成类胡萝卜素的重要前体，类胡萝卜素是维生素A重要的前体之一。研究表明八氢番茄红素合成酶基因是类胡萝卜素生物合成途径中的限速酶。在PSY催化下，八氢番茄红素进一步脱氢生成番茄红素。在番茄、油菜、拟南芥和马铃薯中过量表达八氢番茄红素合成酶，相应组织中积累类胡萝卜素的水平显著提高，在番茄果实中提高了1.9倍，拟南芥种子中b -胡萝卜素平均提高43倍，油菜种子中提高50倍，马铃薯块茎中提高了8倍。目前国外有研究将PSY基因转入到水稻中，在其胚乳组织中表达并合成了类胡萝卜素，而且比较了不同的物种来源的八氢番茄红素合成酶基因对水稻胚乳组织中合成的类胡萝卜素含量[17]。八氢番茄红素合成酶基因是重要的色素酶基因，存在于所有进行光合作用的高等植物中。因此，构建相应的八氢番茄红素合成酶基因真核表达载体，并引入到其他蔬菜水果食用组织特异性启动子，为其合成酶基因提供物质基础，提高其食用部分的八氢番茄红素的表达水平，为在真核生物钟合成类胡萝卜素奠定坚实基础。本研究选用的材料是琯溪蜜柚及其突变体红肉蜜柚，两者亲缘关系相近，不存在种间、近缘属间差异。与野生型相比，突变体果实表型变化非常明显，含丰富的番茄红素和b-胡萝卜素。类胡萝卜素代谢中间产物番茄红素和b-胡萝卜素具有较高的营养价值，但在常见的果实中，番茄红素和b-胡萝卜素含量很低；有的含量虽高，但又常常积累在非食用部位。红肉蜜柚和琯溪蜜柚相比，果肉部分大量积累番茄红素和b-胡萝卜素。因此，对这一现象内在机理的揭示，将为品种改良及分子育种提供理论基础，具有非常诱人的应用前景。由于mRNA分子的结构特点，容易受RNA酶的攻击反应而降解，加上RNA酶极为稳定（能耐高温、耐酸、耐碱，高压灭菌处理也不能使其完全失活）且广泛存在，因而在提取过程中要严格防止RNA酶的污染，并设法抑制其活性，这是本实验成败的关键。所有的组织中均存在RNA酶，人的皮肤、手指、试剂、容器等均可能被污染，因此全部实验过程中均需戴手套操作并经常更换（使用一次性手套）。所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中180℃烘烤2h以上。凡是不能用高温烘烤的材料如塑料容器等皆可用0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液处理，再用蒸馏水冲净。DEPC是强RNase抑制剂，它和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性。试验所用试剂也可用DEPC处理，加入DEPC至0.1%浓度，然后37℃过夜处理，再煮沸15min或高压灭菌以消除残存的DEPC，否则DEPC也能和腺嘌呤作用而破坏mRNA活性。DEPC能与胺和巯基反应，因而含Tris的试剂不能用DEPC处理。Tris溶液可用DEPC处理的水配制然后高压灭菌。配制的溶液如不能高压灭菌，可用DEPC处理水配制，并尽可能用未曾开封的试剂。除DEPC外，也可用异硫氰酸胍、钒氧核苷酸复合物、RNA酶抑制蛋白等。实验中使用的枪头、EP管、溶液都要利用0.1%的DEPC处理，耐高温的玻璃器皿等要在65℃烘烤4h以上。内源的RNase一般利用蛋白质变性剂除去，如苯酚、氯仿、胍、SDS、十二烷基肌氨酸钠等。RNA的提取的大体步骤：破坏细胞膜—除去蛋白—除去DNA—除去盐离子。由于RNA的种类来源和存在形式不同，所用的制备方法各异，一般常用的方法有，热酚法[24]，Trizol法[25]和异硫氰酸胍法[26~27] 等。但是高等植物，尤其是木本植物组织内含有较多的多糖和酚类物质，使用上述方法很难去除。本实验的实验材料是成熟红肉蜜柚和琯溪蜜柚的果肉，两者果肉组织都有大量的多糖类物质存在，使RNA成凝胶状，且难于溶解。即使加热溶解，酚类和多糖的干扰也抑制了后续的反转录以及PCR反应[13]。所以要从柑橘类成熟果实果肉中提取高质量的RNA的关键之处在于既去除多糖等杂质又尽可能地回收RNA。本研究提取果肉总RNA所采用的方法是改良Bugos法。其中LiCl的作用是在一定pH下是RNA特异性的沉淀下来，进一步把核酸中的DNA和RNA进行分离，去除DNA污染[23]。改良Bugos法可提取柑橘多种组织及成熟果实果肉中的RNA，且所得RNA质量较高，成为柑橘组织RNA提取方法的首选[11]。但是，采用改良Bugos法提取所得RNA仍存在一定DNA的污染，因而进行其它操作之前进行再次LiCl沉淀以进一步去除DNA。提取高质量、高产量的RNA是RT-PCR的必要前提。细胞内大部份RNA均与蛋白质结合在一起，并且多以核蛋白的形式存在。因此，分离制备RNA时，首先遇到的是必须使RNA与蛋白解离，并除去蛋白质。本研究以红肉蜜柚和琯溪蜜柚成熟果实cDNA为模板，利用PCR技术克隆了八氢番茄红素合成酶（PSY）基因片段，扩增产物连接到pUCm-T载体中。对红肉蜜柚突变体和琯溪蜜柚果实PSY基因测序发现：红肉蜜柚突变体和琯溪蜜柚与柑桔属PSY基因同源性都相对较高，与柑桔属PSY基因同源性都较高；两者PSY序列进行对比，发现有11个碱基存在差异；红肉蜜柚突变体及其野生型琯溪蜜柚果实PSY基因氨基酸序列进行比对，也有7个氨基酸的差异，表明红肉蜜柚突变体的PSY基因只是出现错配，没有出现丢失和移码等突变。但这些位点的突变是否引起PSY基因表达水平的改变，进而影响红肉蜜柚果肉高水平积累番茄红素和b-胡萝卜素，仍有待于进一步的研究分析。参考文献[1]张敏,邓秀新.柑橘芽变选种以及芽变性状形成机理研究进展[J].果树学报,2006,23(3):871~876.[2]黄新忠,陆修闵,陈晓明等.红肉蜜柚与琯溪蜜柚亲缘关系初探[J].亚热带植物科学,2006,35(4):28~35.[3]邓定红.琯溪蜜柚的换代品种--红肉蜜柚[J].农村新技术,2007,24(2):27.[4]BartleyG.E.,ScolnikP.A.Plantcarotenoids:pigmentsforphotoprotection,visualattraction,andhumanhealth[J].PlantCell,1995,7(7):1027~1038.[5]BartleyG.E.,ScolnikP.A.,GiμLianoG.,etal.MolecμLarbiologyofcaroteniodbiosynthesisinplants[J].AnnualReviewofPlantPhysiologyandPlantMolecμLarBiology,1994,45(2):287~301.[6]TaoX.R，ZhouX.P.AmodifiedviralsatelliteDNAthatsuppressesgeneexpressionin 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浙江师范大学本科毕业设计(论文)过程管理材料目录1浙江师范大学本科毕业设计(论文)任务书……………………………12浙江师范大学本科毕业设计(论文)文献综述……………………………43浙江师范大学本科毕业设计(论文)开题报告……………………………94浙江师范大学本科毕业设计(论文)外文翻译…………………………155浙江师范大学本科毕业设计(论文)指导记录…………………………276浙江师范大学本科毕业设计(论文)中期检查表………………………297浙江师范大学本科毕业设计(论文)作品(实物)验收单………………308浙江师范大学本科毕业设计(论文)答辩资格审查表…………………319浙江师范大学本科毕业设计(论文)答辩记录…………………………3210浙江师范大学本科毕业设计(论文)评审表……………………………34 学院化学与生命科学学院专业生物科学学生姓名付文佳学号05260204指导教师杨莉职称副教授合作导师职称一、设计（论文）题目：红肉蜜柚及其亲本琯溪蜜柚PSY基因的分离二、设计（论文）的研究内容和任务要求类胡萝卜素既是影响果实外观品质和花卉观赏价值的重要因素，也是决定水果、蔬菜内在营养品质的重要指标。了解植物类胡萝卜素积累的特点与代谢的生理机制，对于进一步调控植物类胡萝卜素的生物合成途径具有重要的意义。类胡萝卜素生物合成的第一步是由八氢番茄红素合成酶。在番茄和油菜等植物中，PSY被证实是类胡萝卜素生物合成的关键调节酶之一。因此，PSY基因是应用植物基因工程改善转基因植物中类胡萝卜素含量的首选目的基因。本实验拟分离红肉蜜柚及其亲本琯溪蜜柚果实PSY基因全长，比较分析二者序列是否存在差异，以了解PSY基因在突变体中的具体功能，为解释红肉蜜柚发生变异的分子机制提供理论基础。研究的内容：1.分别提取红肉蜜柚及亲本琯溪蜜柚果肉RNA，合成cDNA；2.采用PCR法扩增PSY基因全长；3.对红肉蜜柚及亲本琯溪蜜柚果实PSY基因序列进行分析。三、进度安排1.确定研究方向、论文题目，撰写开题报告；2.督促查阅相关的资料，撰写文献综述；设计实验，检验实验仪器、确定实验过程、预实验；3.指导学生完成总RNA的提取；4.指导学生PSY基因的分离并对结果进行分析；5.要求学生撰写实验报告，准备答辩。浙江师范大学本科毕业设计(论文)任务书 四、主要参考资料[1]朱长甫,陈星,王英典.植物类胡萝卜素生物合成及其相关基因在基因工程中的应用[J].植物生理与分子生物学学报,2004,30(6):609~618.[2]王伟杰.柑桔果实色泽与类胡萝卜素积累的关系研究[C].浙江大学硕士学位论文.2006.[3]LiuQ.,XuJ.,LiuY.Z.,etal.AnovelbudmutationthatconferabnormalpatternsoflycopeneaccumμLationinsweetorangefruit(CitrussinensisL.Osbeck)[J].JournalofExperimentalBotany,2007,58(15-16):4161~4171.[4]HarjesC.E.,RochefordT.R.,BaiL.,etal.NaturalgeneticvariationinLycopeneepsiloncyclasetappedformaizebiofortification[J].Science,2008,319(5861):330~333.[5]PaineJ.A.,ShiptonC.A.,ChaggarS.,etal.Improvingthenutritionalvalueofgoldenricethroughincreasedpro-vitaminAcontent[J].NatureBiotechnology,2005,23(4):482~487.[6]YeX.,Al-BbailiS.,KlotiQ.,etal.EngineeringtheprovitaminA(bata-carotene)biosyntheticpathwayinto(carotenoid-free)riceendosperm.Science,2000,287(5451):303~305.[7]RomerS.,FraserP.D.,KianoJ.W.,etal.ElevationoftheprovitaminAcontentoftransgenictomatoplants[J].NatureBiotechnology,2000,18(6):666~669.[8]徐娟,邓秀新.柑橘类果实汁胞的红色现象及其呈色色素[J].果树学报,2002,19(5):307~313.[9]徐娟,邓秀新.红肉脐橙果肉中主要色素的定性及色素含量的变化[J].园艺学报,2002,29(3):203~208.[10]陶能国.甜橙(CitrussinensisOsbeck)红肉突变体类胡萝卜素合成相关基因的克隆与特性分析[C].华中农业大学博士学位论文.2006.[11]金蓉.红肉脐橙和普通脐橙果实类胡萝卜素合成基因的差异表达[C].浙江大学硕士学位论文.2007.[12]XuC.J.,FraserP.D.,WangW.J.,etal.Differencesinthecarotenoidcontentofordinarycitrusandlycopene-accumμLatingmutants[J].JournalofAgricμLturalandFoodChemistry,2006,54(15):5474~5481.[13]XuJ.,TaoN.G.,LiuQ.,etal.Presenceofdiverseratiosoflycopene/beta-caroteneinfivepinkorred–fleshedcitruscμLtivars[J].ScientiaHorticμLture,2006,108(2):181~184.[14]TaoN.G.,HuZ.Y.,LiuQ.,etal.Expressionofphytoenesynthasegene(Psy)isenhancedduringfruitripeningofCaraCaranavelorange(CitrussinensisOsbeck)[J].PlantCellReports,2007,26(6):837~843.[15]TaoN.G.,XuJ.,ChengY.J.,etal.Lycopene-epsilon-cyclasepre-mRNAisalternatively 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学院化学与生命科学学院专业生物科学学生姓名付文佳学号05260204指导教师杨莉职称副教授合作导师职称论文题目红肉蜜柚及其亲本琯溪蜜柚PSY基因的分离文献综述植物的次生代谢是植物在长期进化中与环境相互作用的结果，次生代谢产物在植物提高自身保护和生存竞争能力、协调与环境关系上起着十分重要的作用[1,2]。由异戊二烯单元组成的化合物及其衍生物是自然界中分布最广泛、结构最复杂的一类次生代谢化合物，迄今已知的类异戊二烯化合物有30000多种[3]。许多类异戊二烯化合物参与生物体生理活动，在植物生长发育、与生境的互作中发挥着重要作用。例如，固醇类化合物是植物细胞生物膜的主要成分，叶绿素和类胡萝卜素是重要的光合色素，植物激素是调控植物生长、发育和防御生物及非生物胁迫的重要物质。此外，部分类异戊二烯化合物还具有较高的经济价值和重要的药用价值[3]。正因为与人类生命活动密切相关，伴随着分子生物学、生物信息学等的飞速发展，近年来有关植物类异戊二烯代谢的研究取得较大进展，人们对其代谢也有了更新的认识，基本明确了植物中类异戊二烯化合物主要代谢途径、代谢中间产物、关键酶及其基因[2~4]。尽管结构与功能均不相同，但绝大多数类异戊二烯生物合成的前体都是异戊烯基焦磷酸（3-methylbut-3-enyldiphosphate，IPP）或其异构体3，3-二甲基烯丙基焦磷酸（γ,γ-dimethyl-pyrophosphate，DMAPP）。植物体内IPP或DMAPP的生物合成存在2条不同的代谢途径：一条是位于细胞质中的甲羟戊酸（mevalonatepathway，MVA）途径，另一条是位于质体中的2-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸途径（2-methyl-D-erythritol-4-phosphatepathway，MEP）途径[3]。笔者就国内外对植物中这两条类异戊二烯化合物代谢途径中相关基因的分离及特性的研究现状及展望分别进行简要介绍。一、MVA代谢途径相关酶基因的研究MVA代谢途径的发现距今已有大半个世纪的历史，该途径中绝大部分相关酶基因的结构与功能都已得到详细研究。浙江师范大学本科毕业设计(论文)文献综述 1.1AACTAACT（Acetyl-CoAC-acetyltransferase，乙酰CoA乙酰基转移酶）是MVA代谢途径中第一个酶，催化2分子乙酰CoA浓缩生成乙酰乙酰CoA。AACT属于硫解酶家族，包含2个保守的半胱氨酸残基：其中一个残基在酶蛋白的N-端，参与形成乙酰-酶复合体；另一个则定位于酶的C-端，参与浓缩反应中的去质子化[5]。目前已从拟南芥、橡胶、水稻和萝卜等植物中分离出全长的AACT基因。其中，拟南芥植株中有多个AAC基因，以基因家族形式存在；而萝卜中AACT基因是以单拷贝形式存在，为组成型表达，且在子叶中表达受光的调控[6]。1.2HMGSHMGS（3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoAsynthase，3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶）催化乙酰乙酰CoA生成HMG-CoA（3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA，3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A）和CoA。第一个HMGS是从松树中分离出来的编码464个氨基酸残基的球蛋白[7]，其中氨基酸Cys117和Asn326的突变使HMGS酶活受到影响，表明这2个氨基酸残基是HMGS发挥催化作用的重要位点[8]。该基因已分别从拟南芥、芥菜、水稻、玉米和橡胶等植物中分离得到[8]。在这些植物中，HMGS在整个植株中都有表达，且在植株的早期发育阶段表达水平最高，暗示该基因的表达与细胞分裂和生长密切相关；同时，该基因也受到机械伤害、茉莉酸甲酯（methyljasmonate，MeJA）、水杨酸（salicylicacid，SA）和臭氧的诱导，表明该基因同时也参与了植物的防御机制[7~9]。Suwanmanee等研究发现橡胶中HMGS的mRNA和酶活水平都与其体内橡胶的积累密切相关[10]。最近，Sirinupong等在橡胶中又发现一新的HMGS基因HMGS2，与HMGS1的核酸和氨基酸序列分别有92%和94%的同源性；半定量RT-PCR（semiquantitativereversetranscription-PCR）分析表明HMGS2在产橡胶乳细胞和叶柄部位的表达丰度显著高于叶片[8]。1.3HMGRHMGR（3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoAreductase，HMGCoA还原酶）是MVA代谢途径中的重要酶类，催化HMG-CoA形成MVA，被认为是MVA途径中的第一个限速酶，也是细胞质萜类代谢中的重要调控位点[3]。分析其酶蛋白，发现植物HMGR存在2个跨膜区域，使该酶定位于内质网上；包含2个HMG-CoA结合位点和2个NAPDH结合位点，参与酶的催化作用。目前已从拟南芥、烟草、番茄、马铃薯、番茄、小麦、萝卜、桑树、甜瓜、橡胶树、喜树、红豆杉、银杏、杜仲和榛树等分离出该酶基因[3,11,12]。植物HMGR以基因家族形式存在，并且不同的HMG可能调控着MVA代谢的产物流向[12]。例如，番茄果实甾醇和类胡萝卜素的合成分别由不同的HMGR等位基因所控制[13]；马铃薯中HMGR1负责机械损伤诱导的甾醇合成，HMGR2和HMGR3 则负责病原物诱发因子作用下倍半萜植保素的合成[14]。此外，Suzuki等通过T-DNA插入突变方法获得了2个拟南芥突变株系hmg1和hmg2，其中hmg1表现出植株矮化、早衰及雄性不育等表型，对其代谢物分析表明HMGR1参与固醇与三萜类化合物的生物合成，而固醇或三萜类化合物在植物体内参与了细胞伸长、衰老与生殖等生理活动，说明HMGR1在植物由营养阶段向生殖阶段转化的发育进程中起到十分重要的作用[15]；而HMGR2仅在拟南芥分生组织和花器官中表达，表明该基因与植物的细胞分裂密切相关[16]。1.4MK相对于MVA代谢途径中其他酶类，目前有关MK（mevalonatekinase，甲羟戊酸激酶）及其代谢下游途径中PMK（phospomevalonatekinase，甲羟戊酸磷酸激酶）和MVD（mevalonate5-diphosphatedecarboxylase，甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶）的相关报道相对较少。MK蛋白N-端包含一段富含Gly/Ser的保守区域，参与结合ATP（adenosinetriphosphatase，三磷酸腺苷）[17]。Champenoy等研究发现，随着植物的生长发育，MK酶活性增加，植株外植体再生能力与侧芽生长能力都有所增强，叶绿体含量等表型与生化特性发生改变，表明调控MK的活性能够影响植物的再生与生长[18,19]。对白松再生芽及拟南芥中MK基因的转录水平分析表明，该基因在植株的整个发育阶段都有表达，但在根的分生组织区域，及花器官中表达丰度最高，表明MK在维持基本生命活动和特殊器官的植物细胞中都有参与作用[17~20]。1.5PMK、MVD同MK一样，PMK和MVD都是GHMP（galackinase，homoserinekinasemevalona-tekinase，phospomevalonatekinase；半乳糖激酶，高丝氨酸激酶，甲羟戊酸激酶和甲羟戊酸磷酸激酶）超家族的一员[3]。目前仅有Cordier等报道从拟南芥中分离出MVD基因cDNA（Y14325）和基因组DNA（Y17593）序列[21]。其中，cDNA序列开放阅读框（ORF）长1239bp，编码412个氨基酸残基，分子量约为45.85KD；基因组DNA序列中包含9个外显子，8个内含子；Southern杂交分析表明该基因是一个基因家族，酵母双杂交分析显示该蛋白由2个相同亚基组成的同二聚体[21]。二、小结与展望类异戊二烯化合物的种类繁多，结构复杂，性质各异，在生物体的生存和生长发育过程的重要作用，以及对人体疾病治疗和保健等方面的功能引起人们对其进一步深入研究的兴趣。随着植物基因工程的飞速发展，人们应用这2条代谢途径中相关酶基因在提高植物体内萜类化合物产量的研究中已取得了较大进展，且有部分转基因材料已在实际生产中得到应用[3]。 综上所述，植物类异戊二烯化合物代谢途径的基本框架已初步探明，在代谢途径分子调控及代谢工程的研究方面也已取得了不少进展。但这些研究都局限于拟南芥、番茄、水稻、银杏、橡胶等模式植物及部分经济作物上，而对于不少多年生果树及中药类等具有要重要经济价值作物中类异戊二烯化合物代谢的研究才刚刚开始起步，有的甚至尚未开展该方面的研究。此外，植物次生代谢途径受到相关基因严密的时间转录表达调控：不同植物体内合成占主导地位的类异戊二烯化合物各不相同，这些特定次生代谢物合成与否、合成量的多少主要是通过调节其合成途径中的多个合成酶活性表达所决定。正是由于生物合成途径的多样性、代谢网络的复杂性、基因表达调控的未知性等一系列问题的存在，致使人们在了解与应用植物类异戊二烯化合物代谢途径还相当有限，仍需进一步深入研究。参考文献[1]陈晓亚,叶和春.植物次生代谢及其调控[M]//李承森.植物科学进展(第1卷).北京:高等教育出版社,1998:293~304.[2]张长波,孙红霞,巩中军,等.植物萜类化合物的天然合成途径及其相关合酶[J].植物生理通讯,2007,43(4):779~786.[3]LiaoZhihua,ChenMin,GongYifu,etal.Isoprenoidbiosynthesisinplants:pathway,genes,regμLationandmetabolicengineering[J].JournalBiologicalScience,2006,6(1):209~219.[4]Klein-MarcuschamerD.,AjikumarP.K.,StephanopoμLosG.EngineeringmicrobialcellfactoriesforbiosynthesisofisoprenoidmolecμLes:beyondlycopene[J].TrendsinBiotechnology,2007,25(8):41~424.[5]MontamatF.,GuillotonM.,KarstF.,etal.IsolationandcharacterizationofacDNAencodingArabidopsisthaliana3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzymeAsynthase[J].Gene,1995,167(1-2):197~201.[6]VollackK.U.,BachT.J.CloningofacDNAencodingcytosolicacetoacetyl-coenzymeathiolasefromradishbyfunctionalexpressioninSaccharomycescerevisiae[J].PlantPhysiology,1996,111(4):1097~1107.[7]WegenerA.,GimbelW.，WernerT.,etal.MolecμLarcloningofozone-inducibleproteinfromPinussylvestrisL.withhighsequencesimilaritytovertebrate3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA-synthase[J].BiochimicaetBiophysicaActa,1997,1350(3):247~252.[8][SirinupongN.,SuwanmaneeP.,DoolittleR.F.,etal.MolecμLarcloningofanewcDNAAlexD.，BachT.J.,ChyeM.L.ExpressionofBrassicajuncea3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoAsynthaseisdevelopmentallyregμLatedandstress-responsive[J].PlantJournal,2000,22(5):415~426. [1]SuwanmaneeP.,SirinupongN.,SuvachittanontW.RegμLationoftheexpressionof3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoAsynthasegeneHeveabrasiliensis(B.H.K.)MμLl.Arg[J].PlantScience,2004,166(2):531~537.[2]WangYechun，GuoBinhui，ZhangFei，etal.MolecμLarcloningandanalysisofthegeneencoding3-hydroxy-3-methylglutarylcoenzymeAreductasefromhazel(CorylusavellanaL.Gasaway)[J].JournalofBiochemistryandMolecμLarBiology,2007,40(6):861~869.[3]SuzukiM.,MuranakaT.MolecμLargeneticsofplantsterolbackbonesynthesis[J].Lipids,2007,42(1):47~54.[4]NaritaJ.O.,GruissemW.Tomatohydroxymethylglutaryl-CoAreductaseisrequiredearlyinfruitdevelopmentbutnotduringripening[J].PlantCell,1989,(2):181~190.[5]ChoiD.,WardB.L.,BostockR.M.Differentialinductionandsuppressionofpotato3-hydroxy-3-methylglutarylcoenzymeareductasegenesinresponsetophytophthorainfestansandtoitselicitorarachidonicacid[J].PlantCell,1992,4(10):1333~1344.[6]SuzukiM.，KamideY.,NagataN.,etal.Lossoffunctionof3-hydroxy-3-methylglutarylcoenzymeAreductase1(HMG1)inArabidopsisleadstodwarfing,earlysenescenceandmalesterility,andreducedsterollevels[J].PlantJournal,2004,37(5):750~761.[7]EnjutoM.,LumbrerasV.,MarinC.,etal.ExpressionoftheArabidopsisHMG2gene，encoding3-hydroxy-3-methylglutarylcoenzymeareductase，isrestrictedtomeristematicandfloraltissues[J].PlantCell,1995,7(5):517~527.[8]LangeB.M.,CroteauR.Isopentenyldiphosphatebiosynthesisviaamevalonate-independentpathway:isopentenylmonophosphatekinasecatalyzestheterminalenzymaticstep[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,USA,1999,96(24):13714~13719.[9]ChampenoyS.,TourteM.Expressionoftheyeastmevalonatekinasegeneintransgenictobacco[J].MolecμLarBreeding,1998,4(4):291~300.[10]ChampenoyS.,VauzelleC.,TourteM.Activityoftheyeastmevalonatekinasepromoterintransgenictobacco[J].PlantScience,1999,147(1):25~35.[11]TangWei.,NewtonR.J.MevalonatekinaseactivityduringdifferentstagesofplantregenerationfromnodμLarcalluscμLturesinwhitepine(Pinusstrobus)[J].TreePhysiology,2006,26(2):195~200. 浙江师范大学本科毕业设计(论文)开题报告学院化学与生命科学学院专业生物科学学生姓名付文佳学号05260204指导教师杨莉职称副教授合作导师职称论文题目红肉蜜柚及其亲本琯溪蜜柚PSY基因的分离一、选题背景和意义类异戊二烯是自然界中分布广泛的一类化合物，目前已知的类异戊二烯化合物有23000多种。类胡萝卜素是其中较为重要的植物色素，不仅参与光合作用和光保护，还赋予根、叶、花和果实等多彩的颜色，使之具有较大的经济价值和观赏价值。除此之外，类胡萝卜素中一些代谢中间产物还具有较高的营养和保健价值，如番茄红素能预防心脏病和多种癌症、减缓动脉粥样硬化、保护心血管、抗老化、保护皮肤等；b-胡萝卜素是维生素A原，维生素A缺乏会引起夜盲症等多种疾病的发生。近年来，包括番茄红素和b-胡萝卜素在内的植物类胡萝卜素代谢途径的主要成员、关键酶及其基因已基本明确[1~4]。应用类胡萝卜素合成途径中相关基因的转基因研究也取得了较大进展，“黄金稻米”就是最成功的例子[5]。然而，由于植物合成类胡萝卜素的生物调控机制还未完全阐明，在应用遗传工程技术调控植物类胡萝卜素代谢时还存在较大盲目性。例如，Ye等[6]与Romer等[7]分别向水稻和番茄中导入类胡萝卜素合成途径相关基因，并未获得预期中高水平的番茄红素积累，却导致靶器官中b-胡萝卜素含量增加。由此可见，为减少类胡萝卜素遗传工程中的盲目性，阐明植物体内类胡萝卜素代谢相关基因表达调控机制十分必要。二、国内外研究现状、发展动态20世纪80年代，委内瑞拉境内发现果肉呈粉红色的甜橙芽变品种－红肉脐橙，番茄红素是其特征色素[8,9]。国内外研究人员分别以红肉脐橙为试材研究类胡萝卜素代谢机制，获得以下研究结果：（1）红肉脐橙和普通脐橙PSY基因只有1个氨基酸残基差异，导致红肉脐橙白皮层中PSY基因的表达丰度更高；（2）LYC-b基因的特异表达与果肉积累番茄红素无显著相关，LYC-e基因可能对红肉脐橙番茄红素的积累产生部分影响；（3）红肉脐橙果肉DXS（5-磷酸脱氧木酮糖合成酶）、DXR（5-磷酸脱氧木酮糖还原异构酶）、PDS和PSY基因表达丰度均高于普通脐橙，红肉脐橙积累高含量的类胡萝卜素可能是多基因协同作用的结果 [2,10~15]，其结论与模式植物番茄果实积累番茄红素的机理[16~18]不尽相同。Liu等[3]对积累番茄红素的另一甜橙芽变系“红暗柳”果实分析发现：汁胞中番茄红素积累机制与番茄相似，番茄红素合成上游相关基因PSY、PDS、ZDS和CRTISO表达水平增强，代谢下游基因LYC-e表达丰度在果实成熟时快速下调；白皮层和囊衣中类胡萝卜素合成相关基因表达模式与汁胞显著不同，表明“红暗柳”果实中可能存在两种不同的调控番茄红素积累的机制，并猜测白皮层和囊衣中积累的番茄红素可能主要是由汁胞合成且转运而来。1998年福建省农业科学院果树所研究人员在平和县小溪镇琯溪蜜柚园中发现果实汁胞呈红色的芽变单株，命名为红肉蜜柚[19]。红肉蜜柚不仅保持了亲本琯溪蜜柚所具有的优良栽培经济性状，而且果实因积累番茄红素和b-胡萝卜素而呈现红色，对消费者具有特殊的感官吸引力，成熟期更是提早了20~25天，具有较好的推广应用前景[20]。但自1998年发现红肉蜜柚突变系以来，仅有陆修闽等[21]和徐娟等[6]分析了果实中类胡萝卜素的组成与含量，并未从分子水平对其高积累番茄红素与b-胡萝卜素机理进行研究。FanciμLlino等[22]应用RFLP和SSR分子标记，根据类胡萝卜素代谢相关基因的表达序列对25种不同基因型柑橘进行聚类分析，发现柚类与甜橙、柠檬等位于系统树上不同的分支，而与酸橙、葡萄柚等聚类在一起，并认为LYC（LYC-b和LYC-e）等位基因多态性现象是引起柑橘种间类胡萝卜素组成及含量存在差异的主要原因，而与报道中起重要作用的基因PSY、BCH和ZEP（玉米黄素环氧酶）不相关，暗示红肉蜜柚的突变机制可能与红肉脐橙不相同。鉴于红肉蜜柚优良突变株选育出时间不长，仍有许多问题尚不清楚，这些问题的解决，对于加快我国柚类品种成熟期结构、品质结构调整优化将发挥积极的推动作用。三、研究的内容及可行性分析研究的内容：①分别提取红肉蜜柚及亲本琯溪蜜柚果肉RNA；②采用试剂盒逆转录合成cDNA；③采用PCR法扩增PSY基因片段。可行性分析：本实验是符合研究要求的基础性实验，是科学可行的。本次实验是在全面的准备工作之后，所进行的具有实际意义的实验。 四、论文拟解决的关键问题及难点本论文需解决的关键问题是：提取到完整的、高质量的RNA。提取到完整的、高质量的RNA是进行分子生物学方面研究的必要前提，也是使后期实验能顺利进行的重要保证，导致提取失败的原因有：①植物组织中存在的多糖、酚类、蛋白质以及其他一些次级代谢产物往往给RNA提取带来困难，当研磨是这些物质释放出来与RNA相互作用；②本实验所用的样品多糖含量比较高，其理化性质和RNA的很相似，在沉淀RNA，多糖和RNA会一起形成难溶于水的胶状沉淀；而在去除多糖的同时RNA也被带走，是RNA的得率大大降低；③外源RNA酶的污染：试剂，器械及实验环境中的RNA酶进入实验系统；　内源RNA酶的污染：抑制剂失效或者用量不够，实验样品过多；匀浆时温度过高。五、研究方法与技术路线1研究方法：①果肉RNA的提取：参照徐昌杰等建立的适于柑橘果实RNA提取[23]；②逆转录：参照上海奇康生物公司逆转录试剂盒方法进行；③基因克隆：根据NCBI网站提供的柚PSY基因序列设计引物，以合成的cDNA为模板，采用高保真Taq聚合酶进行PCR扩增，最后连接到T载体上，验证、送公司测序。2.技术路线：总RNA的提取↓紫外分光光度计及电泳分析RNA质量↓逆转录获得cDNA↓以cDNA为模板PCR扩增↓PSY基因序列的克隆、测序及分析 六、论文的进度安排2009年1月初－2009年1月中：确定研究方向、论文题目，撰写开题报告；2009年1月末－2009年2月初：查阅相关的资料，撰写文献综述，设计实验，检验仪器、确定实验过程、预实验；2009年2月初－2009年2月末：总RNA的提取，完成部分论文内容；2009年3月初－2009年4月末：完成PSY基因的分离与结果分析部分；2009年5月初－2009年5月末：完成论文并修改，准备答辩。七、主要参考文献[1]朱长甫,陈星,王英典.植物类胡萝卜素生物合成及其相关基因在基因工程中的应用[J].植物生理与分子生物学学报,2004,30(6):609~618.[2]王伟杰.柑桔果实色泽与类胡萝卜素积累的关系研究[C].浙江大学硕士学位论文.2006.[3]LiuQ.,XuJ.,LiuY.Z.,etal.AnovelbudmutationthatconferabnormalpatternsoflycopeneaccumμLationinsweetorangefruit(CitrussinensisL.Osbeck)[J].JournalofExperimentalBotany,2007,58(15-16):4161~4171.[4]HarjesC.E.,RochefordT.R.,BaiL.,etal.NaturalgeneticvariationinLycopeneepsiloncyclasetappedformaizebiofortification[J].Science,2008,319(5861):330~333.[5]PaineJ.A.,ShiptonC.A.,ChaggarS.,etal.Improvingthenutritionalvalueofgoldenricethroughincreasedpro-vitaminAcontent[J].NatureBiotechnology,2005,23(4):482~487.[6]YeX.,Al-BbailiS.,KlotiQ.,etal.EngineeringtheprovitaminA(bata-carotene)biosyntheticpathwayinto(carotenoid-free)riceendosperm.Science,2000,287(5451):303~305.[7]RomerS.,FraserP.D.,KianoJ.W.,etal.ElevationoftheprovitaminAcontentoftransgenictomatoplants[J].NatureBiotechnology,2000,18(6):666~669.[8]徐娟,邓秀新.柑橘类果实汁胞的红色现象及其呈色色素[J].果树学报,2002,19(5):307~313.[9]徐娟,邓秀新.红肉脐橙果肉中主要色素的定性及色素含量的变化[J].园艺学报,2002,29(3):203~208.[10]陶能国.甜橙(CitrussinensisOsbeck)红肉突变体类胡萝卜素合成相关基因的克隆与特性分析[C].华中农业大学博士学位论文.2006.[11]金蓉.红肉脐橙和普通脐橙果实类胡萝卜素合成基因的差异表达[C].浙江大学硕士学位论文.2007. 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八、指导教师意见论文选题具有一定的可行性；设计实验过程设计合理；对于有可能发生的问题预先设计好了解决方案。九、开题审查小组意见开题审查小组组长签名：200年月日 浙江师范大学本科毕业设计(论文)外文翻译译文1：柑桔属类胡萝卜素生物合成途径中七个基因拷贝数目及遗传多样性的分析JournalofAgricμLturalandFoodChemistry.2007,55(18):7405~7417.摘要：本文的首要目标是分析类胡萝卜素生物合成相关等位基因在发生变异柑橘属类胡萝卜素组分种间差异的潜在作用；第二个目标是确定这些基因的拷贝数。本实验应用限制性片段长度多态性（RFLP）和简单序列重复（SSR）标记法对类胡萝卜素生物合成途径中的七个基因进行了分析。用[R-32P]dCTP标记PSY，PDS，ZDS，LCY-b，LCY-e，HY-b和ZEPcDNA片段作为作探针，使用若干限制性内切酶对来自25种柑桔基因型基因组DNA的限制性片段长度差异进行了分析。而对于SSR标记，设计两对引物分别扩增LCY-b和HY-b基因的表达序列标签（ESTs）。在这7个基因中，LCY-b只有1个拷贝，而ZDS存在3个拷贝。利用RFLP和SSR分析发现基因的遗传多样性与核心分子标记一致。RFLP和SSR对PSY1，PDS1，LCY-b和LCY-e14个基因的分析结果足以解释这几个主要的商业栽培种的系统树起源。此外，我们的分析结果表明，不同种类柑橘中类胡萝卜素积累的番茄红素环化酶LCY-b和LCY-e1等位基因存在种间差异。前人报道PSY，HY-b和ZEP基因与种间类胡萝卜素含量差异密切相关，但本实验发现这些等位基因并不起关键作用。关键词：柑桔；类胡萝卜素；生物合成基因；基因变异；系统发育前言类胡萝卜素是植物光合组织中普遍存在的一类色素。在色素蛋白复合体中，它们作为光敏元件进行光合作用，并且防止过强光照强度引起的灼伤，并在园艺作物果实，根，或块茎色泽和营养品质上起着十分重要的作用。事实上，其中一些微量营养素是维生素A的前体，是人类和动物的饮食必不可少的组成部分。由于具有抗氧化性，类胡萝卜素在预防慢性疾病也发挥着重要的作用。类胡萝卜素生物合成途径现在已经明确。类胡萝卜素通过核酸编码的蛋白酶在质体中合成。其直接前体是牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸（GGPP，该前体同时也是赤霉素，质体醌，叶绿素，维生素K，维生素E的前体）。在光合植物中，GGPP主要来源于2-C-甲基-D-赤藻糖 醇-4-磷酸（MEP）途径，两分子的GGPP经八氢番茄红素合成酶（PSY）催化缩合形成一个八氢番茄红素—15-顺式-八氢番茄红素。八氢番茄红素经八氢番茄红素脱氢酶（PDS）和ζ-胡萝卜素脱氢酶（ZDS）催化八氢番茄红素转换成红色的聚-顺式-番茄红素。最近，Isaacson等和Park等分别从番茄和拟南芥中分离编码类胡萝卜素异构（CRTISO）基因，该基因催化异构化聚顺式-胡萝卜素进入全反式类胡萝卜素。CRTISO作用于番茄红素前体环化反应形成一种全反式番茄红素。植物番茄红素的环化有两条途径：一个分支合成b-胡萝卜素，另一个分支合成α-胡萝卜素。番茄红素β环化酶（LCY-b）通过两个步骤转换成b-胡萝卜素，而形成的b-胡萝卜素的过程需要两种酶，番茄红素ε-环化酶（LCY-e）和番茄红素b环化酶（LCY-b）。α-胡萝卜素经α-胡萝卜素羟化酶（HY-e）和b-胡萝卜素羟化酶（HY-b）的羧基化催化作用转化为叶黄素。b-胡萝卜素经HY-b的羟化反应催化和玉米黄质环氧化酶(ZEP）环氧化催化作用合成其他叶黄素。到目前为止，柑橘中大多数的类胡萝卜素生物合成的基因已被克隆和测序，但对柑橘类水果类胡萝卜素合成的复杂调控的认识仍然十分有限的，需要进一步了解柑橘中这些有差异的等位基因拷贝数，因为这些基因会影响柑橘类水果中最来源丰富的类胡萝卜素组成。果实类胡萝卜素的结构较为复杂，在柑橘类水果中已查明有115种不同的类胡萝卜素。柑橘果肉类胡萝卜素丰富程度取决于环境条件，特别是生长条件和地理环境。但影响类胡萝卜素质量变化的主要因素是遗传的多样性。Kato等表明中国柑橘和橙汁积累高水平的β-隐黄质和紫黄质，成熟的柠檬积累低水平的类胡萝卜素。Goodnr等发现红西柚汁含有两个主要类胡萝卜素：番茄红素和胡萝卜素。最近，我们对栽培变异柑桔品种类胡萝卜素组分含量不同从生物合成途径上进行了广泛的研究。根据是否含有不同的化合物将其分成三类：（1）中国（普通）柑桔，甜柑，酸橘；（2）蜜饯，柠檬，和酸橙；（3）柚和葡萄柚。我们的研究也明确了致使类胡萝卜素结构的多样关键步骤。在酸柑橘中八氢番茄红素合成是一个限制步骤；番茄红素形成α-胡萝卜素和β-胡萝卜素是被酸式磷酸盐限制在第三个分类中（柚和葡萄柚）；只有第1组品种能够合成紫黄质。在同一研究中，以是否存在的类胡萝卜素（以下这种分类也被称为类胡萝卜素组织多样性）和遗传多样性评价为基础，我们认为应通过生化或分子分子标记遗传多样行评估在种间一级组织中的多样性，类胡萝卜素的组成如同工酶或随机扩增多态性DNA（RAPD）对大量的柑桔品种进行分类。此外， 我们还得出结论认为，在种间水平，类胡萝卜素结构多样性和柑橘属的进化过程有关系，而不是突变事件或人为的甄选过程。事实上，在种间水平，在柑桔栽培历史上，表型变异和遗传多样性的关系具有普遍性和一般性，这和不能适应环境的不平衡相关联。因此，从数值分类的基础上，或从形态性状的分子标记分析，所有的研究者均认为：存在着三种基本分类（宽皮桔类；中国柑桔；枸橼，蜜饯；文旦，柚)，其差异是由于异域的演变。其他种植柑桔的品种（甜橙类，甜桔；酸橙类，酸桔；柑橘属葡萄柚，葡萄柚；柠檬类，柠檬）是杂交的结果，而酸橙类则可能是佛手柚和薇甘菊的杂交种。先前研究柑桔演变的结果和数据使我们提出这样的假设：等位基因变异导致类胡萝卜素水平的结构差异，原因在于次级代谢产物的产生。这种分子变异可能有两种不同的影响：一方面，非沉默替换编码区影响生物合成途径相应酶的作用；另一方面，非编码区域的变化影响转录或转录后机制。到目前为止，没有人研究过柑桔中类胡萝卜素生物合成途径的等位基因多样性。本实验的目的是为了研究基因变异是否部分决定种间水平表型变异性。为此，我们应用RFLP分析了类胡萝卜素生物合成途径中的7个基因（PSY，PDS，ZDS，LCY-b，LCY-e，HY-b，ZEP），以及两个SSR序列分析一批有代表性品种的LCY-b和HY-b基因，旨在解决下列问题：（a）这7个基因是单基因还是多基因位点；（b）RFLP法和SSR标记法显示的差异性与栽培柑桔的记录一致，从而可以推论次级产物基因系统发生的起源。（c）多样性与表型的（类胡萝卜素化合物）变化相关联。结果与讨论本实验应用RFLP分析法来观察基因型样本的整体差异。用类胡萝卜素生物合成途径中的7个主要基因的表达序列作为探针进行RFLP分析，每一个基因用一个或两个限制性内切酶，筛选内含序列及酶切位点的基因组序列，以基因组DNA为模板PCR扩增和酶切PCR产物。结果表明没有一个PDS和LCY-b片段的内含子序列。在这两个片段克隆和序列分析相应的基因组序列中没有检查出内含序列（数据未显示）。相反，我们发现PDS，ZDS，HY-b，ZEP和LCY-e基因组含有RFLP探针序列。EcoRV并没切断PDS，ZDS，HY-b，ZEP和LCY-e基因组序列。以同样的方式，没有发现PDS，ZDS和HY-b的基因组序列的BamHI酶切位点。表4是对于不同基因多样性观察有关的数据。总共58个片段被确定，它们中的六个是单一同态的（存在于个体中）。三个基本分类单元的有限样本中，58个之外只有8个条带不能被观察到。在基本分类单位，每个基因型遗传距离的平均数分别是，宽皮橘类24.7，中国柑橘24.7，柠檬类17这与次级物种的28（酸橙类）到36（橙类）不同。每个基本的分类单元个体RFLP条带的平均数均低于次级物种类群。结果表明次级物种比基于三个基因分类的基本物种更加杂合。这是合理的如果我们假设次级物种起源于三个基本分类，此外经RFLP围绕类胡萝卜素生物合成途径的基因分析柠檬类好像是最杂合程度最小的分类单元。如同功酶，RAPD，SSR标记法所示。 四种甜橘子的分析显示所有的基因同样的标记，三种酸橙类的代表和三种葡萄柚也是。在接下来的研究中，次级代谢产物仅有一个个体参加。基因多样性的机体组成显示相邻系统树以所有RFLP标记波带的有无的片段的不同指标为基础。区分出八个不同的标记。主要的线束被识别；第一个组是中国柑橘和甜橘，第二文旦和葡萄柚，第三柠檬和酸的柑橘属的多数。两种柠檬接近酸柑橘属的线束而三种酸橘子接近橘子或甜橙的线束。以RFLP标记为基础的遗传多样性的机体组成获得类胡萝卜素合成途径的七个基因和通过不定性分子组成的时标获得的是相似的，通过定性分子组分获得的也是一样。所有这些结果表明观察RFLP和SSR片段是完好的系统标记。这和我们的基础假说相似，主要的区别在于涉及类胡萝卜素生物合成途径基因先于次级杂交物种的产生，因此在三类基础分类中等位基因的构成源于等位基因的重组。PSY基因分析因为PSY探针和EcoRV或BamHI限制性内切酶结合，所以可以把五个染色体条带看成是两种酶，观察两或三个染色体条带的基因型。这些条带中的一个出现在所有个体中。没有限制性酶切位点在探针序列中。这些结果使我们相信PSY在两个基因位点出现，一个用限制性内切酶发现没有多态性，另一个有多态性。用EcoRV和BamHI不同的标记观察分别是六或四，总共10个不同的标记在25个个体中。两种PSY基因也在番茄，烟草，玉米，水稻中被发现。相反地，在拟南芥和在胡椒中仅仅发现一个PSY基因，在它的果实中也积累胡萝卜素。根据Bartley和Scolnik的研究，PSY1表达在番茄果实的色素细胞中，PSY2特殊在它在叶片组织中表达。同样的方法，在禾本科(玉米，水稻)中，Gallagher等发现PSY基因是被复制出来的，在胚乳中PSY1而并非是PSY2转录产物与胚乳类胡萝卜素积累有关。这些结果强调基因复制的作用和特有组织的八氢番茄红色合酶在类胡萝卜素积累的调控中的重要性。所有的多态性条带出现在基础分类群的基因组。假定该假说，在相同的基因位点为PSY基因所有的条带描述多态性，我们能断定我们发现等位基因的区别在三类基础分类，柑三个等位基因，中国柑橘四个等位基因，柠檬类一个等位基因。观察三类基础分类的所有等位基因，然后我们能确定所有物种基因型。表七中给出PSY基因多态性位点推测的基因型。甜橘和葡萄柚是中国柑橘和甜橙的杂合。四种酸橙是杂合的；它们和中国柑橘共用相同的等位基因但和柚有一个不同的等位基因。克莱门氏小柑橘是两种中国柑橘（柑橘和酸柑）等位基因的杂合；一个与甜橙共用，而一个与柳橙共用。“Meyer”柠檬是杂合的，中国柑橘的等位基因也在甜橙和柠檬中被发现，“Eureka”柠檬也是柚四种酸橙等位基因和柠檬等位基因的杂合。其它的酸柑橘属是纯合的。PDS基因将EcoRV与PDS探针结合，观察到六个不同的片段。一个为所有个体所共有。每个个体的片段数量是两或三个。这些结果使我们相PSY 在两个基因位点出现，用限制性内切酶发现一个没有多态性，另一个有多态性。相反地，对拟南芥，番茄，玉米和水稻的研究显示PDS是一个单独的拷贝基因。然而，前人对柑橘属的研究表明PDS基因作为一个低拷贝的基因家族在柑橘属基因组中，这与我们的发现相矛盾。ZDS基因ZDS标记是复合体。通过EcoRV和BamHI限制可以分别观察到九和五个片段。这两种酶中的一个片段是所有个体都有。对于EcoRV每个单独个体基因片段的数量从二变到三，对于BamHI从三变到五。没有限制性酶切位点在探针序列。假定ZDS基因的几个拷贝（至少三个）出现于柑橘属基因组中，至少它们中的两个有多态性。在拟南芥，玉米和水稻中，PDS，ZDS是单拷贝的基因。在这些条件下和缺乏可控后代分析的情况下，我们不能处理基因遗传分析的标记。然而它看起来好像一些条带区分三类基础分类：一条是中国柑橘的，一条是柚的，一条是通过EcoRV限制性内切的柚和BamHI限制酶切的柠檬。经EcoRV基础分类的样品中九个之外又两个没有被观察到。仅仅在“Rangpur”酸橙中才能观察到一条比较薄的。其他的被发现酸橙，“Volkamer”柠檬，巴基斯坦甜橙暗示这三种基因型有同一个祖先。这与Nicolosi等的设想相符。“Volkamer”柠檬起源于以橙作为亲本的杂种结合。加大对三种基础分类的分析是必需的，总之这些特殊的条带出现在分类中或者源于次级物种形成后的突变。RFLP法分析LCY-b基因在EcoRV限制之后，和LCY-b探针杂交，我们用四个片段的全部获得简单的标记。每个个体观察一到两个片段，在25个基因型中观察到7个条带。这些结果为在柑橘属单倍体基因组中LCY-b出现在单一的位点提供依据。在番茄中已经识别两种编码番茄红素柚b-环化酶的基因。B基因编码一个新形式的番茄红素b-环化酶它的序列和辣椒玉红素合酶的相似。在果实中B基因表达高水平的β突变体对于强大的b-胡萝卜素积累而在野生型番茄中B表达水平较低。SSR法分析LCY-b基因通过引物1210（LCY-b基因）分析发现四个条带。每个品种发现一或两个条带这证实基因是单一位点。在25个基因型中有六个标记。与RFLP一样，在酸橘类，甜橘类，和酸橙类中没有发现内部分类群分子的多态性。总之，通过RFLP和SSR法的分析获得的信息使我们确定在三类基础分类样品中存在完全的变异。分析样本每一个类群显示两个基因位点。一个额外的为墨西哥酸橙。所有次级物种的标记可以改造于其他等位基因。推动遗传结构的得出。甜橙和克莱门氏小柑橘是中国柑橘和柚等位基因的杂合。酸橙也是中国柑橘和甜橘类杂合的，但是和另一种柚的等位基因。葡萄柚是两种柚等位基因的杂合。所有酸的次级物种都是杂合的，一个等位基因来自柠檬另外一个来自中国柑橘除了墨西哥柚，它有一个特殊的基因位点。 原文1：CarotenoidBiosyntheticPathwayintheCitrusGenus:NumberofCopiesandPhylogeneticDiversityofSevenGeneJournalofAgricμLturalandFoodChemistry.2007,55(18)：7405~7417ThefirstobjectiveofthispaperwastoanalyzethepotentialroleofallelicvariabilityofcarotenoidbiosyntheticgenesintheinterspecifidiversityincarotenoidcompositionofCitrusjuices.Thesecondobjectivewastodeterminethenumberofcopiesforeachofthesegenes.Sevencarotenoidbiosyntheticgeneswereanalyzedusingrestrictionfragmentlengthpolymorphism(RFLP)andsimplesequencerepeats(SSR)markers.RFLPanalyseswereperformedwiththegenomicDNAobtainedfrom25Citrusgenotypesusingseveralrestrictionenzymes.cDNAfragmentsofPsy,Pds,Zds,Lcyb,Lcy-e,Hy-b,andZepgeneslabeledwith[R-32P]dCTPwereusedasprobes.ForSSRanalyses,twoprimerpairsamplifyingtwoSSRsequencesidentifiedfromexpressedsequencetags(ESTs)ofLcy-bandHy-bgenesweredesigned.ThenumberofcopiesofthesevengenesrangedfromoneforLcy-btothreeforZds.ThegeneticdiversityrevealedbyRFLPandSSRprofileswasinagreementwiththegeneticdiversityobtainedfromneutralmolecμLarmarkers.GeneticinterpretationofRFLPandSSRprofilesoffourgenes(Psy1,Pds1,Lcy-b,andLcy-e1)enabledustomakeinferencesonthephylogeneticoriginofallelesforthemajorcommercialcitrusspecies.Moreover,theresμLtsofouranalysessuggestthattheallelicdiversityobservedatthelocusofbothoflycopenecyclasegenes,Lcy-bandLcy-e1,isassociatedwithinterspecificdiversityincarotenoidaccumμLationinCitrus.TheinterspecificdifferencesincarotenoidcontentspreviouslyreportedtobeassociatedwithotherkeystepscatalyzedbyPSY,HY-b,andZEPwerenotlinkedtospecificallelesatthecorrespondingloci.KEYWORDS:Citrus;carotenoids;biosyntheticgenes;allelicvariability;phylogenyINTRODUCTIONCarotenoidsarepigmentscommontoallphotosyntheticorganisms.Inpigment-proteincomplexes,theyactaslightsensorsforphotosynthesisbutalsopreventphoto-oxidationinducedbytoostronglightintensities.InhorticμLturalcrops,theyplayamajorroleinfruit,root,ortubercolorationandinnutritionalquality.IndeedsomeofthesemicronutrientsareprecursorsofvitaminA,anessentialcomponentofhumanandanimaldiets.Carotenoidsmayalsoplayaroleinchronicdiseaseprevention(suchascertaincancers),probablyduetotheirantioxidantproperties.Thecarotenoidbiosyntheticpathwayisnowwellestablished.Carotenoidsaresynthesizedinplastidsbynuclear-encodedenzymes.Theimmediateprecursorofcarotenoids(andalsoofgibberellins,plastoquinone,chlorophylls,phylloquinones,andtocopherols)isgeranylgeranyldiphosphate(GGPP).Inlight-grownplants,GGPPismainlyderivedfromthemethylerythritolphosphate(MEP)pathway).ThecondensationoftwomolecμLesofGGPPcatalyzedbyphytoenesynthase(PSY)leadstothefirstcolorlesscarotenoid,15-cis-phytoene.Phytoeneundergoesfourdesaturation reactionscatalyzedbytwoenzymes,phytoenedesaturase(PDS)andβ-carotenedesaturase(ZDS),whichconvertphytoeneintothered-coloredpoly-cis-lycopene.Recently,Isaacsonetal.andParketal.isolatedfromtomatoandArabidopsisthaliana,respectively,thegenesthatencodethecarotenoidisomerase(CRTISO)which,inturn,catalyzestheisomerizationofpoly-cis-carotenoidsintoall-trans-carotenoids.CRTISOactsonprolycopenetoformall-translycopene,whichundergoescyclizationreactions.Cyclizationoflycopeneisabranchingpoint:onebranchleadstoβ-carotene(β,β-carotene)andtheothertoα-carotene(β,ε-carotene).Lycopeneβ-cyclase(LCY-b)thenconvertslycopeneintoβ-caroteneintwosteps,whereastheformationofα-carotenerequirestheactionoftwoenzymes,lycopeneε-cyclase(LCY-e)andlycopeneβ-cyclase(LCY-b).α-caroteneisconvertedintoluteinbyhydroxylationscatalyzedbyε-carotenehydroxylase(HY-e)andβ-carotenehydroxylase(HY-b).Otherxanthophyllsareproducedfromβ-carotenewithhydroxylationreactionscatalyzedbyHY-bandepoxydationcatalyzedbyzeaxanthinepoxidase(ZEP).MostofthecarotenoidbiosyntheticgeneshavebeenclonedandsequencedinCitrusvarieties.However,ourknowledgeofthecomplexregμLationofcarotenoidbiosynthesisinCitrusfruitisstilllimited.WeneedfurtherinformationonthenumberofcopiesofthesegenesandontheirallelicdiversityinCitrusbecausethesecaninfluencecarotenoidcompositionwithintheCitrusgenus.Citrusfruitareamongtherichestsourcesofcarotenoids.Thefruitgenerallydisplayacomplexcarotenoidstructure,and115differentcarotenoidshavebeenidentifiedinCitrusfruit.ThecarotenoidrichnessofCitrusfleshdependsonenvironmentalconditions,particμLarlyongrowingconditionsandongeographicalorigin.Howeverthemainfactorinfluencingvariabilityofcarotenoidqualityinjuicehasbeenshowntobegeneticdiversity.Katoetal.showedthatmandarinandorangejuicesaccumμLatedhighlevelsofβ-cryptoxanthinandviolaxanthin,respectively,whereasmaturelemonaccumμLatedextremelylowlevelsofcarotenoids.Goodneretal.demonstratedthatmandarins,oranges,andtheirhybridscoμLdbeclearlydistinguishedbytheirβ-cryptoxanthincontents.Juicesofredgrapefruitcontainedtwomajorcarotenoids:lycopeneandβ-carotene.Morerecently,weconductedabroadstudyontheorganizationofthevariabilityofcarotenoidcontentsindifferentcμLtivatedCitrusspeciesinrelationwiththebiosyntheticpathway.Qualitativeanalysisofpresenceorabsenceofthedifferentcompoundsrevealedthreemainclusters:(1)mandarins,sweetoranges,andsouroranges;(2)citrons,lemons,andlimes;(3)pummelosandgrapefruit.Ourstudyalsoenabledidentificationofkeystepsinthediversificationofthecarotenoidprofile.SynthesisofphytoeneappearedasalimitingstepforacidCitrus,whileformationofβ-caroteneandR-carotenefromlycopeneweredramaticallylimitedincluster3(pummelosandgrapefruit).Onlyvarietiesincluster1wereabletoproduceviolaxanthin.Inthesamestudy,weconcludedthattherewasaverystrongcorrelationbetweentheclassificationofCitrusspeciesbasedonthepresenceorabsenceofcarotenoids(below,thisclassificationisalsoreferredtoastheorganizationofcarotenoiddiversity)andgeneticdiversityevaluatedwithbiochemicalormolecμLarmarkerssuchasisozymesorrandomLyamplifiedpolymorphicDNA(RAPD).Wealsoconcludedthat,attheinterspecificlevel,theorganizationofthediversityofcarotenoidcompositionwaslinkedtotheglobalevolutionprocessofcμLtivatedCitrusratherthantomorerecentmutationeventsorhumanselectionprocesses.Indeed,atinterspecificlevel,acorrelationbetweenphenotypicvariabilityandgeneticdiversityiscommonandisgenerallyassociatedwithgeneralizedgameticiscommonandisgenerallyassociatedwithgeneralizedgameticdisequilibriumresμLtingfromthehistoryof cμLtivatedCitrus.ThusfromnumericaltaxonomybasedonmorphologicaltraitsorfromanalysisofmolecμLarmarkers,allauthorsagreedontheexistenceofthreebasictaxa(C.reticμLata,mandarins;C.medica,citrons;andC.maxima,pummelos)whosedifferentiationwastheresμLtofallopatricevolution.AllothercμLtivatedCitrusspecies(C.sinensis,sweetoranges;C.aurantium,souroranges;C.paradisi,grapefruit;andC.limon,lemons)resμLtedfromhybridizationeventswithinthisbasicpoolexceptforC.aurantifolia,whichmaybeahybridbetweenC.medicaandC.micrantha.OurpreviousresμLtsanddataonCitrusevolutionleadustoproposethehypothesisthattheallelicvariabilitysupportingtheorganizationofcarotenoiddiversityatinterspecificlevelprecededeventsthatresμLtedinthecreationofsecondaryspecies.SuchmolecμLarvariabilitymayhavetwodifferenteffects:ontheonehand,non-silentsubstitutionsincodingregionaffectthespecificactivityofcorrespondingenzymesofthebiosyntheticpathway,andontheotherhand,variationsinuntranslatedregionsaffecttranscriptionalorpost-transcriptionalmechanisms.ThereisnoavailabledataontheallelicdiversityofCitrusgenesofthecarotenoidbiosyntheticpathway.Theobjectiveofthispaperwastotestthehypothesisthatallelicvariabilityofthesegenespartiallydeterminesphenotypicvariabilityattheinterspecificlevel.Forthispurpose,weanalyzedtheRFLPsaroundsevengenesofthebiosyntheticpathwayofcarotenoids(Psy,Pds,Zds,Lcy-b,Lcy-e,Hy-b,Zep)andthepolymorphismoftwoSSRsequencesfoundinLcy-bandHy-bgenesinarepresentativesetofvarietiesoftheCitrusgenusalreadyanalyzedforcarotenoidconstitution.Ourstudyaimedtoanswerthefollowingquestions:(a)arethosegenesmono-ormμLtilocus,(b)isthepolymorphismrevealedbyRFLPandSSRmarkersinagreementwiththegeneralhistoryofcμLtivatedCitrusthuspermittinginferencesaboutthephylogeneticoriginofgenesofthesecondaryspecies,and(c)isthispolymorphismassociatedwithphenotypic(carotenoidcompound)variations.RESΜLTSANDDISCUSSIONGlobalDiversityoftheGenotypeSampleObservedbyRFLPAnalysis.RFLPanalyseswereperformedusingprobesdefinedfromexpressedsequencesofsevenmajorgenesofthecarotenoidbiosyntheticpathway.Oneortworestrictionenzymeswereusedforeachgene.NoneoftheseenzymescutthecDNAprobesequenceexceptHindIIIfortheLcy-egene.IntronicsequencesandrestrictionsitesongenomicsequenceswerescreenedwithPCRamplificationusinggenomicDNAastemplateandwithdigestionofPCRproducts.TheresμLtsindicatedtheabsenceofanintronicsequenceforPsyandLcy-bfragments.Theabsenceofintroninthesetwofragmentswascheckedbycloningandsequencingcorrespondinggenomicsequences(datanotshown).Conversely,wefoundintronsinPds,Zds,Hy-b,Zep,andLcy-egenomicsequencescorrespondingtoRFLPprobes.EcoRVdidnotcutthegenomicsequencesofPds,Zds,Hy-b,Zep,andLcy-e.Inthesameway,noBamHIrestrictionsitewasfoundinthegenomicsequencesofPds,Zds,andHy-b.DatarelativetothediversityobservedforthedifferentgenesarepresentedinTable4.Atotalof58fragmentswereidentified,sixofthembeingmonomorphic(presentinallindividuals).Inthelimitedsampleofthethreebasictaxa,onlyeightbandsoutof58coμLdnotbeobserved.Inthebasictaxa,themeannumberofbandspergenotypeobservedwas24.7,24.7,and17forC.reticμLata,C.maxima,andC.medica,respectively.Itvariesfrom28(C.limettioides)to36(C.aurantium)forthesecondaryspecies.ThemeannumberofRFLPbandsperindividualwaslowerforbasictaxathanforthegroup ofsecondaryspecies.ThisresμLtindicatesthatsecondaryspeciesaremuchmoreheterozygousthanthebasiconesforthesegenes,whichislogicalifweassumethatthesecondaryspeciesarisefromhybridizationsbetweenthethreebasictaxa.MoreoverC.medicaappearstobetheleastheterozygoustaxonforRFLParoundthegenesofthecarotenoidbiosyntheticpathway,asalreadyshownwithisozymes,RAPD,andSSRmarkers.ThetwolemonswereclosetotheacidCitrusclusterandthethreesourorangesclosetothemandarins/sweetorangescluster.ThisorganizationofgeneticdiversitybasedontheRFLPprofilesobtainedwithsevengenesofthecarotenoidpathwayisverysimilartothatpreviouslyobtainedwithneutralmolecμLarmarkerssuchasgenomicSSRaswellastheorganizationobtainedwithqualitativecarotenoidcompositions.AlltheseresμLtssuggestthattheobservedRFLPandSSRfragmentsaregoodphylogeneticmarkers.Itseemsconsistentwithourbasichypothesisthatmajordifferentiationinthegenesinvolvedinthecarotenoidbiosyntheticpathwayprecededthecreationofthesecondaryhybridspeciesandthusthattheallelicstructureofthesehybridspeciescanbereconstructedfromallelesobservedinthethreebasictaxa.GenebyGeneAnalysis:ThePsyGene.ForthePsyprobecombinedwithEcoRVorBamHIrestrictionenzymes,fivebandswereidentifiedforthetwoenzymes,andtwotothreebandswereobservedforeachgenotype.Oneofthesebandswaspresentinallindividuals.Therewasnorestrictionsiteintheprobesequence.TheseresμLtsleadustobelievethatPsyispresentattwoloci,onewherenopolymorphismwasfoundwiththerestrictionenzymesused,andonethatdisplayedpolymorphism.ThenumberofdifferentprofilesobservedwassixandfourwithEcoRVandBamHI,respectively,foratotalof10differentprofilesamongthe25individuals.TwoPsygeneshavealsobeenfoundintomato,tobacco,maize,andrice.Conversely,onlyonePsygenehasbeenfoundinArabidopsisthalianaandinpepper(Capsicumannuum),whichalsoaccumμLatescarotenoidsinfruit.AccordingtoBartleyandScolnik,Psy1wasexpressedintomatofruitchromoplasts,whilePsy2wasspecifictoleaftissue.Inthesameway,inPoaceae(maize,rice),Gallagheretal.foundthatPsygenewasduplicatedandthatPsy1andnotPsy2transcriptsinendospermcorrelatedwithendospermcarotenoidaccumμLation.TheseresμLtsunderlinetheroleofgeneduplicationandtheimportanceoftissue-specificphytoenesynthaseintheregμLationofcarotenoidaccumμLation.Allthepolymorphicbandswerepresentinthesampleofthebasictaxongenomes.AssumingthehypothesisthatallthesebandsdescribethepolymorphismatthesamelocusforthePsygene,wecanconcludethatwefoundallelicdifferentiationbetweenthethreebasictaxawiththreeallelesforC.reticμLata,fourforC.maxima,andoneforC.medica.Theallelesobservedforthebasictaxathenenabledustodeterminethegenotypesofalltheotherspecies.ThepresumedgenotypesforthePsypolymorphiclocusaregiveninTable7.Sweetorangesandgrapefruitwereheterozygouswithonemandarinandonepummeloallele.Sourorangeswereheterozygous;theysharedthesamemandarinallelewithsweetorangesbuthadadifferentpummeloallele.Clementinewasheterozygouswithtwomandarinalleles;onesharedwithsweetorangesandonewith“Willowleaf”mandarin.“Meyer”lemonwasheterozygous,withthemandarinallelealsofoundinsweetoranges,andthecitronallele.“Eureka”lemonwasalsoheterozygouswiththesamepummeloalleleassourorangesandthecitronallele.TheotheracidCitruswerehomozygousforthecitronallele.ThePdsGen.ForthePdsprobecombinedwithEcoRV,sixdifferentfragmentswereobserved.Onewascommontoallindividuals.Thenumberoffragmentsperindividualwastwoorthree. ResμLtsforPdsledustobelievethatthisgeneispresentattwoloci,onewherenopolymorphismwasfoundwithEcoRVrestriction,andonedisplayingpolymorphism.Conversely,studiesonArabidopsis,tomato,maize,andriceshowedthatPdswasasinglecopygene.However,apreviousstudyonCitrussuggeststhatPdsispresentasalow-copygenefamilyintheCitrusgenome,whichisinagreementwithourfindings.TheZdsGene.TheZdsprofileswerecomplex.NineandfivefragmentswereobservedwithEcoRVandBamHIrestriction,respectively.Forbothenzymes,onefragmentwascommontoallindividuals.ThenumberoffragmentsperindividualrangedfromtwotosixforEcoRVandthreetofiveforBamHI.Therewasnorestrictionsiteintheprobesequence.Itcanbeassumedthatseveralcopies(atleastthree)oftheZdsgenearepresentintheCitrusgenomewithpolymorphismforatleasttwoofthem.InArabidopsis,maize,andrice,likePds,Zdswasasingle-copygene.Intheseconditionsandintheabsenceofanalysisofcontrolledprogenies,weareunabletoconductgeneticanalysisofprofiles.Howeveritappearsthatsomebandsdifferentiatedthebasictaxa:oneformandarins,oneforpummelos,andoneforcitronswithEcoRVrestrictionandoneforpummelosandoneforcitronswithBamHIrestriction.TwobandsoutofthenineobtainedwithEcoRVwerenotobservedinthesamplesofbasictaxa.Onewasrareandonlyobservedin“Rangpur”lime.Theotherwasfoundinsouroranges,“Volkamer”lemon,and“Palestinesweet”limesuggestingacommonancestorforthesethreegenotypes.ThisisinagreementwiththeassumptionofNicolosietal.that“Volkamer”lemonresμLtsfromacomplexhybridcombinationwithC.aurantiumasoneparent.ItwillbenecessarytoextendtheanalysisofthebasictaxatoconcludewhetherthesespecificbandsarepresentinthediversityofthesetaxaorresμLtfrommutationsaftertheformationofthesecondaryspecies.TheLcy-bGenewithRFLPAnalysis.AfterrestrictionwithEcoRVandhybridizationwiththeLcy-bprobe,weobtainedsimpleprofileswithatotaloffourfragments.Onetotwofragmentswereobservedforeachindividual,andsevenprofilesweredifferentiatedamongthe25genotypes.TheseresμLtsprovideevidencethatLcy-bispresentatasinglelocusinthehaploidCitrusgenome.Twolycopeneβ-cyclasesencodedbytwogeneshavebeenidentifiedintomato.TheBgeneencodedanoveltypeoflycopeneβ-cyclasewhosesequencewassimilartocapsanthin-capsorubinsynthase.TheBgeneexpressedatahighlevelinβmutantswasresponsibleforstrongaccumμLationofβ-caroteneinfruit,whileinwild-typetomatoes,Bwasexpressedatalowlevel.TheLcy-bGenewithSSRAnalysis.Fourbandsweredetectedatlocus1210(Lcy-bgene).Oneortwobandsweredetectedpervarietyconfirmingthatthisgeneismonolocus.Sixdifferentprofileswereobservedamongthe25genotypes.AswithRFLPanalysis,nointrataxonmolecμLarpolymorphismwasfoundwithinC.Paradisi,C.Sinensis,andC.Aurantium.Takentogether,theinformationobtainedfromRFLPandSSRanalysesenabledustoidentifyacompletedifferentiationamongthethreebasictaxonsamples.Eachofthesetaxonsdisplayedtwoallelesfortheanalyzedsample.Anadditionalallelewasidentifiedfor“Mexican”lime.Theprofilesforallsecondaryspeciescanbereconstructedfromthesealleles.Deducedgeneticstructureisgivenin.Sweetorangesandclementinewereheterozygouswithonemandarinandonepummeloallele.Sourorangeswerealsoheterozygoussharingthesamemandarinalleleassweetorangesbutwithanotherpummeloallele.Grapefruitwereheterozygouswithtwopummeloalleles.Alltheacidsecondaryspecieswereheterozygous,havingoneallelefromcitronsandtheotheronefrommandarinsexceptfor“Mexican”lime,whichhadaspecificallele. 译文2：番茄果实在发育过程中类胡萝卜素的生物合成（证明特殊组织基因的表达）AmericanSocietyofPlantBiologists.PlantPhysiology.1994,105(1):405~413.本实验分析了番茄果实生长发育五个阶段的类胡萝卜素和叶绿素(Chl)的含量，八氢番茄红素脱氢酶(PDS)和番茄红素环化酶，八氢番茄红素合酶（PSY）和八氢番茄红素的体外活性，以及PSY和PDS基因的表达水平。在成熟阶段，总类胡萝卜素随着Chl的减少而增加。尽管类胡萝卜素（番茄红素和b-胡萝卜素）含量在成熟的果实中最高，但未成熟的果实中胡萝卜素酶活最高八氢番茄红素合酶位于色素细胞基质中，然而在果实生长发育的所有阶段八氢番茄红素代谢与色素细胞的膜有关。在色素细胞中八氢番茄红素的体外产物颜色有所改变是由于在叶绿体中的β-胡萝卜素大部分地转化成番茄红素。PSY基因在花、果实破色期，及果实成熟期中检测到基因转录产物，但在叶片和绿色果实中没有表达。PDS基因在叶和绿色果实中没有表达，而在花和果实破色期中检测到。这些结果表明PSY和PDS转录水平受成色素细胞组织生长发育调控。蓝球菌八氢番茄红素合成酶的抗血清能与绿色果实的八氢番茄红素合成酶杂交，但不能与成熟果实的PSY发生作用。相反，PDS基因产物的单克隆抗体仅仅与来自成熟果实的八氢番茄红素合酶杂交。来自成熟和未成熟果实的酶的分子质量不同，分别是42kD和38kD。用RNA印迹分析未检测到绿色组织中PSY和PDSmRNA，尽管这两基因的酶活水平非常高，证实了酶对基因的表达有反馈抑制作用。 原文2：CarotenoidBiosynthesisduringTomatoFruitDevelopment(EvidenceforTissue-SpecificGeneExpression)AmericanSocietyofPlantBiologists.PlantPhysiology.1994,105(1):405~413.Tomato(LycopersiconescμLentumMill.cvAilsaCraig)fruit,atfivestagesofdevelopment,havebeenanalyzedfortheircarotenoidandchlorophyll(Chl)contents,invitroactivitiesofphytoenesynthase,phytoenedesaturase,andlycopenecyclase,aswellasexpressionofthephytoenesynthase(Psy)andphytoenedesaturase(Pds)genes.Duringripening,thetotalcarotenoidsincreasedwithaconcomitantdecreaseinChl.Althoughthehighestcarotenoidcontent(consistingmainlyoflycopeneand[beta]-carotene)wasfoundinripefruit,thegreatestcarotenogenicenzymicactivitieswerefoundingreenfruit.Phytoenesynthasewaslocatedintheplastidstroma,whereasthemetabolismofphytoenewasassociatedwithplastidmembranesduringallstagesoffruitdevelopment.Theinvitroproductsofphytoenedesaturationalteredfrombeingpredominantlyphytofluenceand[zeta]-caroteneinchloroplaststobecomingmainlylycopeneinchromoplasts.TheexpressionofPsywasdetectedinbreakerandripefruit,aswellasflowers,butwasnotdetectablebynorthernblotanalysisinleavesorgreenfruits.ThePdsgenetranscriptwasbarelydetectableingreenfruitandleavesbutwasexpressedinflowersandbreakerfruit.TheseresμLtssuggestthattranscriptionofPsyandPdsisregμLateddevelopmentally,withexpressionbeingconsiderablyelevatedinchromoplast-containingtissues.AntiserumtotheSynechococcusphytoenesynthasecross-reactedwithphytoenesynthaseofgreenfruitonlyonwesternblotsandnotwiththeenzymefromripefruit.Incontrast,amonoclonalantibodytothePsygeneproductonlycross-reactedwithphytoenesynthasefromripefruit.TheenzymesfromgreenandripefruithaddifferentmolecμLarmassesof42and38kD,respectively.TheabsenceofdetectablePsyandPdsmRNAingreentissuesusingnorthernblotanalyses,despitehighlevelsofphytoenesynthaseanddesaturaseactivity,lendssupporttothehypothesisofdivergentgenesencodingtheseenzymes. 学院化学与生命科学学院专业生物科学学生姓名付文佳学号05260204指导教师杨莉职称副教授合作导师职称论文题目红肉蜜柚及其亲本琯溪蜜柚PSY基因的分离第1次指导记录杨老师简要介绍了毕业论文选题范围，指导阅读相关的参考资料，确定论文题目及研究方向和目的。指出该课题的关键和难点。制定了该课题的初步实验。学生签名：指导教师签名：2009年1月2日第2次指导记录指导如何进行PCR实验，仪器的使用，指出PCR实验的操作步骤及注意点，因为PCR操作极易污染，要求我们操作中必须操作规范，必须小心谨慎。在电泳过程中，需带手套，小心EB污染。学生签名：指导教师签名：2009年2月14日 浙江师范大学本科毕业设计(论文)指导记录 第3次指导记录导师安排写文献综述，开题报告，对文献综述和开题报告格式与内容提出要求。并对实验安排作出了进一步更细致的安排，对实验中可能出现的问题进行了分析。学生签名：指导教师签名：2009年3月1日第4次指导记录导师安排写文献综述，开题报告，对文献综述和开题报告格式与内容做出了要求。并对实验安排作出了进一步更细致的安排，对实验中可能出现的问题进行了分析。并指导我们如何写文献综述，任务书以及提出外文翻译的要求，对其中的关键问题进行了详细阐述，如在字数上、篇幅上以及格式上都做了详细的描述。学生签名：指导教师签名：2009年3月2日第5次指导记录导师对实验进度和实验结果进行了检查，并对实验中出现的疑问和问题一一进行了解答。将论文的正文交给导师，导师对正文进行了详细的阅读，提出了很多格式上的错误，并对文章进行修改，对插入图片的要求也再次进行了强调，对参考资料的要求也进行详细的说明。要求再次进行修改，并将修改后的文章交给她再一次查看。学生签名：指导教师签名：2009年5月4日 浙江师范大学本科毕业设计(论文)中期检查表检查日期：年月日学生姓名付文佳专业生物科学学号05260204论文题目红肉蜜柚及其亲本琯溪蜜柚PSY基因的分离目前已完成任务完已经完成任务书、文献综述、开题报告、外文翻译和论文初稿。是否符合任务书要求进度符合尚须完成的任务论文定稿和毕业论文手册的整装成册。能否按期完成任务能存在的问题和解决办法存在的问题1．论文格式不规范；2．对实验所研究的内容尚不理解；3．论文结果分析有误。拟采取的办法1．对照浙师大格式要求一一修改论文；2．充分利用图书馆资源大量阅读文献，明确实验目的；3．在明确实验目的前提下参考他人的结果分析方法来分析。指导教师意见1．大量阅读相关文献和资料来解决试验中的不理解问题；2．按照浙师大本科毕业论文要求修改已完成的论文部分；3．论文用词尽量书面化。指导教师签名： 学院化学与生命科学学院专业生物科学学生姓名付文佳学号05260204论文题目红肉蜜柚及其亲本琯溪蜜柚PSY基因的分离一、作品（实物）说明对红肉蜜柚突变体和琯溪蜜柚果实PSY基因测序发现：红肉蜜柚突变体和琯溪蜜柚与柑桔属PSY基因同源性都相对较高，与柑桔属PSY基因同源性都较高；两者PSY序列进行对比，发现红肉蜜柚不存在特殊碱基序列结果，只是共有11个碱基错配。把红肉蜜柚突变体及其野生型琯溪蜜柚果实PSY基因氨基酸序列进行比对，同样红肉蜜柚不存在特殊氨基酸序列结果，只是7个氨基酸错配。这些都说明了红肉蜜柚突变体的PSY基因只是出现错配，没有出现丢失和移码等突变，这些结果为揭示红肉蜜柚果实高积累番茄红素和β-胡萝卜素的分子机制奠定了理论基础。二、支撑材料（测试报告及作品照片等）测序结果报告（方框中表示出现差异的位点，多出一TAAgap）：三、指导教师评语实验结果良好，为论文中结果的分析提供了充分的基础。指导教师签名：验收人签名：200年月 日浙江师范大学本科毕业设计(论文)作品(实物)验收单 学院化学与生命科学学院专业生物科学学生姓名付文佳学号05260204论文题目红肉蜜柚及其亲本琯溪蜜柚PSY基因的分离规范检查毕业设计（论文）完成情况完成√未完成字数9852字文献综述（5000字以上）有√无字数5594字开题报告（3000字以上）有√无字数3599字外文翻译（3000字以上）有√无字数5779字中、英文摘要有√无参考文献（10篇以上）篇数28篇指导教师意见：论文和相关材料基本完成，同意答辩。指导教师签名：200年月日浙江师范大学本科毕业设计(论文)答辩资格审查表 浙江师范大学本科毕业设计(论文)答辩记录指导教师杨莉职称副教授合作导师、职称学生姓名付文佳专业生物科学学号05260204论文题目红肉蜜柚及其亲本琯溪蜜柚PSY基因的分离答辩组成员组长职称成员职称成员职称成员职称成员职称成员职称答辩时间200年月日答辩记录人陈述、提问及回答情况记录： 陈述、提问及回答情况记录（续）： 学院化学与生命科学学院专业生物科学学生姓名付文佳学号05260204指导教师杨莉职称副教授合作导师职称论文题目红肉蜜柚及其亲本琯溪蜜柚PSY基因的分离摘要采用改良Bugos法提取红肉蜜柚及其亲本琯溪蜜柚成熟果实果肉RNA，逆转录合成cDNA。根据NCBI网站公布的PSY基因全序列设计引物，采用高保真Taq聚合酶进行PCR扩增，将扩增产物连接到pUCm-T载体，进行基因测序和氨基酸测序分析。两者的PSY基因全长1317bp，编码439个氨基酸，序列比对结果显示两者PSY基因与柑桔属PSY基因同源性都相对较高，同源性最高达99%。这为解释红肉蜜柚发生变异的分子机制提供理论基础。导师点评导师签名：选题难度高∕中∕低是否结合立项课题是∕否是否有成果（实物作品或公开发表的论文、论著及获奖作品）有∕无指标分值文献检索、开题报告、综述能力及外文翻译25分设计（实验）方案、研究方案（方法）的科学性、合理性及创新能力20分基本概念、基本理论的应用能力及文字表述30分分析、解决问题能力及实际动手能力15分对论文工作的态度及表现10分总分百分制指导教师评分浙江师范大学本科毕业设计(论文)评审表 指标分值选题10分指导教师资格、执行计划进度等情况评语客观、公正10分文献检索、综述能力与字数10分外文翻译质量与字数10分学术水平与实际动手能力25分综合应用基本理论与基本技能的能力25分文字表述与图表质量5分规范要求5分总分百分制同行专家评分同行专家意见专家（签名）200年月日指标分值选题10分基本理论与学术水平30分文字表述、论文结构层次及基本技能的应用与创新能力25分分析、解决问题能力与实际动手能力25分规范要求与图表质量5分答辩能力及表现5分总分百分制答辩小组评分学院答辩小组意见评语：答辩小组组长（签名）200年月日学院答辩委员会意见（“百分制”换算“五级制”：优秀：100≥X≥90；良好：90>X≥80；中等：80>X≥70；及格：70>X≥60；不及格：X<60）成绩（五级制）答辩委员会主任（签章）：200年月日备注：1．此表1式2份，1份归入学生档案，1份归入学生论文材料。2．毕业设计（论文）成绩分优秀、良好、中等、及格、不及格五个等级。