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《蜂蜜中5种双稠吡咯啶类生物碱的测定《蜂蜜中5种双稠吡咯啶类生物碱的测定高效液相色谱-质谱/质谱法》编制说明一、标准制定的任务来源及意义1、任务来源本标准是根据中华全国供销合作总社（供销厅函科字[2013]9号文）下达的任务，名称为《蜂蜜中双稠吡咯啶类生物碱残留的测定》，计划编号为2013GH-1-017，由中华人民共和国江苏出入境检验检疫局动植物与食品检测中心负责制定，本标准由中华全国供销合作总社提出并归口。2、制定标准的意义（1）双稠吡咯啶生物碱广泛存在植物中并具有慢性毒性。据统计，世界上约有3%的有花植物即6000余种植物含有双稠吡咯啶生物碱（Pyrrolizidinealkaloids，PAs）。PAs大多数是由具有双稠吡咯啶环的氨基醇和不同的有机酸两部分缩合形成，其醇部分叫裂碱（necine），酸部分叫裂酸（necicacid）。在双稠吡咯啶环的1，2位可是双键或是他和的单键，l，2位为双键（即可形成烯丙酯结构）的PAs具有肝脏毒性，称为肝毒双稠吡咯啶生物碱（hepatotoxicpyrrlizidine,HPAs）。其中具有环状双内脂的PAs毒性最强，如倒千里光碱等。由于PAs中毒是呈慢性经过，不易引起人们 的注意，且其侵害是不可逆的。表1常见5种双稠吡咯啶类生物碱相关信息序号中文名称英文名称CAS号单一分子量分子结构式化学结构式1倒千里光碱Retrorsine(β-Longilobine)480-54-6351.168182C18H25NO6Monocrotaline2野百合碱315-22-0325.152527C16H23NO63千里光菲灵碱Seneciphylline(a-Longilobine)480-81-9333.157623C18H23NO54千里光宁Senecionine(Integerrimine)130-01-8335.173279C18H25NO55克氏千里光碱senkirkine2318-18-5365.183838C19H27NO6（2）通过食物链在动物源性食品中传递，将危害人体健康。有文献报导，欧洲曾在瑞士阿尔卑斯山脚的蜂蜜样品中检测出PAs，主要是肝毒性的千里光菲灵的含量为30～70μg/kg，也有研究人员发现德国含有臭狗舌草花粉的蜂蜜样品中检出PAs，含量高达0.42~1.48mg/kg。除此之外由于动物误食含PAs植物等情况导致PAs随食物链进入最终的动物源性食品，如羊奶、牛奶和动物内脏中，将潜在危害人体健康。（3）多个西方国家已制定PAs每日最大摄入量，国内大量文献报道毒性，但由于国内无标准检测方法和文献检测方法，无数据积累，未引起相关政府部门重视。欧洲药品局2012年10月25日发布了EMA/HMPC/893108/2011号文 件，在此文件中包括德国、荷兰、新西兰、澳大利亚等在内的国家规定了PAs的每日最大摄入量从0.1μg/kg/day~1μg/kg/day。经查询中国没有任何与PAs相关的标准检测方法和文献检测方法，但国外已有较多针对PAs检测的文献方法。基于以上3点，需要制定标准并开展检测工作，积累数据，防患未然。二、编制依据本标准的编制遵循GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写规则》和GB/T20001.4-2001《标准编写规则第4部分：化学分析方法》和SN/T0001-1995《出品商品中农药、兽药残留量及生物毒素检验方法标准编写的基本规定》的要求进行编写制订的。三、标准制定过程本标准起草单位在2013年2月收到中华全国供销合作总社任务下达文件后，立刻开始着手进行标准文本、编制说明和验证工作。本标准起草人通过查询相关资料和文献，结合已有检测基础，建立了蜂蜜中双稠吡咯啶类生物碱残留的检测方法。经实验研究验证后，方法的灵敏度、特异性和选择性均能满足相应的检测要求。四、主要试验技术论证4.1色谱和质谱条件的优化选择乙腈-水、乙腈-5mmol/L乙酸铵溶液、乙腈-0.1%（v/v）甲酸-5mmol/L乙酸铵溶液作为流动相分析比较5种PAs保留和峰型效果。结果表明，流动相中加入适量乙酸铵能够有助于5种PAs化合物的色谱保留，但峰型会出现略微拖尾现象。而少量甲酸的加入，五种PAs保留时间均有 所提前但峰形更对称，同时正离子模式下，加入少量的酸有利于目标化合物的离子化，灵敏度可提高10~20%。分析中我们对常规碳十八分析色谱柱VarianPolaris（填料粒径5μm）和超高效碳十八分析色谱柱PhenomenexKinetex（填料粒径2.6μm）进行了比对，发现超高效分析色谱柱由于柱效高，每个色谱峰时间约6秒，可以有效分离某些特种蜂蜜（如洋槐）中的干扰（典型蜂蜜基质加标图谱见图1），由于测定PAs种类只有5种（10个离子通道），在不分段扫描的情况下，每个峰的扫描点数可以达到15个，满足定量需要。最终确认优化后的液相色谱梯度洗脱条件见表2表2高效液相色谱梯度洗脱程序时间/min34.5101113流速/mL/min0.50.50.50.50.50.5乙腈/%1010909010100.1%（v/v）甲酸-5mmol/L乙酸铵/%909010109090质谱分析中我们依然采用最为常用的电喷雾电离源（ESI）对5种PAs进行去簇电压、碰撞能量、喷雾气流量的优化，分别选取信号强度最强的两个离子碎片作为定性和定量离子。最终优化后的5种双稠吡咯啶类生物碱母离子、定性和定量离子。图1、倒千里光碱二级碎片全扫描图 图2、千里光宁二级碎片全扫描图图3、野百合碱二级碎片全扫描图图4、千里光菲灵碱二级碎片全扫描图图5、克氏千里光碱二级碎片全扫描图表3母离子待测物Parention（m/z）野百合碱克氏千里光宁倒千里光碱千里光菲啉千里光宁326.3366.5352.3334.4336.35种双稠吡咯啶类生物碱质谱参数定性离子碰撞能量CollisionEnergyeV4240394040定量离子Quantitativeions(m/z)237.2122.3138.3138.4138.2碰撞能量CollisionEnergyeV3149383840IdentificationIons(m/z)120.4168.4120.2120.3120.2尽管有文献报道，双稠吡咯啶类生物碱使用大气压化学电离源（APCI）比电喷雾电离源（ESI）在24 小时不间断分析中信号更稳定，而实际分析中我们发现连续12小时样品连续进样，信号峰面积变化不超过15%，可以满足残留分析的精度要求。4.2固相萃取净化的选择双稠吡咯啶类生物碱在酸性条件下其叔胺基团容易形成阳离子，采用强阳离子固相萃取柱（WatersOasisMCX）进行富集和净化。纯标准溶液（100ng/mL）过柱试验，5种PAs回收率均能达到85%以上。同时对比使用基于改性聚合物固相萃取柱（WatersOasisHLB，60mg/3mL），用磷酸盐缓冲溶液（pH≈9）为上样溶液，水淋洗，甲醇洗脱方式，结果发现野百合碱回收率低于60%，而造成回收率偏低的原因为野百合碱水溶性较好，在完全依靠反相范德华力为保留机理的反相固相萃取柱上保留较弱，容易产生穿透而造成损失。在进行实际样品分析中，发现进口麦努卡等品种蜂蜜在进行阳离子交换富集净化中容易出现堵塞情况，而中国蜂蜜则相对不容易堵塞固相萃取柱，导致这种情况的出现原因在于进口蜂蜜中蛋白质和花粉含量一般都高于中国蜂蜜。在出现堵塞的情况下，建议在过柱之前进行高速离心后（不低于6000转/分钟），过定性滤纸后再进行固相萃取净化。实际分析中在11种蜂蜜中添加1、20和50μg/kg三个浓度，利用强阳离子固相萃取柱进行富集和净化，其回收率和精密度均可达到满意的效果。4p图7油菜蜜中添加5种双稠吡咯啶类生物碱选择离子流图（添加水平1μg/kg）4p4cps 图9椴树蜜中添加5种双稠吡咯啶类生物碱选择离子流图（添加水平1μg/kg）7ppp图10荆条蜜中添加5种双稠吡咯啶类生物碱选择离子流图（添加水平1μg/kg）5p4.3方法的线性范围、回收率和精密度配制浓度为1.0ng/mL、5.0ng/mL、10.0ng/mL、20.0ng/mL、50.0ng/mL和100.0ng/mL的标准溶液，绘制6点标准工作曲线，用浓度对峰面积进行标准曲线绘制，在本浓度范围内，其线性方程相关系数均大于0.99。分别对油菜蜜、荆条蜜、椴树蜜、洋槐蜜、新西兰麦努卡蜂蜜等种蜂蜜样品进行3个不同加标水平的回收率测定，每个水平平行测定6次。5种PAs在1、20和50μg/kg加标水平下，平均回收率为84%~102%，相对标准偏差为3.6%~8.0%。4p4cps图11麦努卡中添加5种双稠吡咯啶类生物碱选择离子流图（添加水平1μg/kg）表45种不同种类蜂蜜中5种PAs的加标回收率及相对标准偏差（n=6）基质添加水平/μg/kg 1.0测定值/μg/kg平均值/μg/kg平均回收率/%RSD/%0.8417.042.40.8216.440.20.9017.242.00.9016.940.81.0219.749.30.8817.844.50.9618.044.20.8516.740.90.8517.842.91.0720.851.90.9818.646.50.9017.943.70.9818.946.10.9818.444.31.0320.150.20.9718.446.10.8516.039.20.9518.344.50.9518.043.30.9718.847.00.9518.145.20.9818.244.60.8117.542.70.8116.239.10.9419.248.00.8617.042.40.9516.440.20.8217.242.00.8216.940.81.0819.749.30.9117.844.50.9117.242.00.8917.643.00.8917.341.81.0219.749.2洋槐蜜20.050.01.0油菜蜜20.050.01.0荆条蜜20.050.01.0椴树蜜20.050.01.0麦努卡20.050.091898991868489888689878410299986.6%3.9%4.0%7.1%5.7%5.7%8.0%4.6%4.5%7.9%4.8%4.7%5.4%3.7%3.6%4.4中国和进口蜂蜜5种双稠吡咯啶类生物碱含量调查对来自中国8 个省及自治区的洋槐蜜、葵花蜜、棉花蜜、油菜蜜、荆条蜜、枣花蜜、荞麦蜜和来自新西兰、西班牙、澳大利亚等国家的进口蜂蜜进行了筛查，结果发现野百合碱、克氏千里光宁和倒千里光碱均未检出，而千里光菲啉和千里光宁在大多数蜂蜜中均能检出，千里光菲啉含量在11.0~31.1μg/kg范围内，千里光宁含量在8.3~29.1μg/kg范围内，具体数值见表3。表3不同种类蜂蜜中5种PAs的含量检测结果Monocrotaline地区蜂蜜种类μg/kg江苏河南新疆宁夏吉林陕西山东内蒙新西兰西班牙澳大利亚油菜蜜荆条蜜葵花蜜棉花蜜NDNDNDNDNDNDNDNDNDNDNDμg/kgNDNDNDNDNDNDNDNDNDNDNDμg/kgNDNDNDNDNDNDNDNDNDNDNDμg/kg11.0ND24.4NDND20.0ND10.631.1ND25.5μg/kg8.310.920.319.222.528.610.727.119.7ND29.1SenkirkineRetrorsineSeneciphyllineSenecionine椴树蜜枣花蜜洋槐蜜 荞麦蜜麦努卡蜜桉树蜜麦努卡蜜注：ND表示未检出（≤1.0μg/kg）参考文献[1]WuB,WuLJ,ChinaJournalofChineseMateriaMedica(吴斌，吴立军，中国中药杂志)2003,28(2):97[2]ArungundrumSP,TamaraN.P,PaulE.B,etal.MutatRes,1999,443:53[3]EuropeanMedicinesAgency.EMA/HMPC/893108/2011[4]ZhangF,WangCH,WangZT,etal.AnalChimActa,2007,605:94[5]BharathiA,WangYH,WangM,etal.JPharmaceutBiomed,2000,28(5):421[6]TomaszM,KarineNI,KG,AnalChimActa,2006,566:157[7]TomaszM,KarineN,KazimierzG,etal.JChromatogrA,2004,1056:91[8]JoachimS,YuriS,MatthiasU,etal.JChromatogrA,2002,967:85[9]CarolineTG,MartinD,ChristopherTE,etal.FoodChem,2013,136:1577[10]KerrieA.B,KeithB,StevenM.C,etal.JAgricFoodChem,2004,52:6664[11]KeithB,CaoY,StevenM.C,JAgricFoodChem,2005,53:1894