蜂蜜抑菌活性检测方法比较研究——毕业论文 17页

湖南农业大学全日制普通本科生毕业论文蜂蜜抑菌活性检测方法比较研究COMPARATIVESTUDYONDETECTIONMETHODSOFANTIBACTERIALACTIVITYOFHONEY学生姓名：学号：年级专业及班级：食品质量与安全指导老师及职称：学院：食品科学技术学院湖南·长沙提交日期：年月 目录摘要1关键词11前言11.1选题背景21.1.1蜂蜜功能21.1.2蜂蜜产业现状21.1.3蜂蜜研究现状31.2研究目的31.3研究方法31.4研究意义42材料与方法42.1试验材料42.1.1供试菌种42.1.2供试蜂蜜42.1.3主要仪器、器皿及用品42.1.4培养基52.2方法52.2.1菌种的活化及菌液的制备52.2.2试验平板的制备52.2.3抑菌试验52.2.4抑菌圈大小测量62.3试验方案62.3.1蜂蜜蜜源对其抑菌活性地影响研究62.3.2试验平板制作方法的比较研究62.3.3试验最适菌及其最适浓度研究6 2.3.4蜂蜜抑菌活性检测方法比较63结果与分析73.1蜂蜜抑菌活性与蜂蜜蜜源的关系73.2试验平板制作方法比较73.3试验平板中最适菌体浓度试验结果83.4蜂蜜抑菌活性检测方法比较结果114结论13参考文献13致谢14 蜂蜜抑菌活性检测方法比较研究摘要：通过比较试验实际操作和结果，获得最佳蜂蜜抑菌活性检测方法，为同行在进行蜂蜜抑菌圈研究选择方法时提供参考。本试验比较了四种蜂蜜，两种试验平板制作方法，三种供试菌，5种浓度的供试菌菌液，以及K-B法、牛津杯法、打孔法三种抑菌活性检测方法。结果表明：洋槐蜜有抑菌活性，用预加菌液倾注平板法制作试验平板、接种菌落数量级约为1×102CFU/mL的大肠杆菌菌液、采用K-B法做定性试验、打孔法做定量实验为检测蜂蜜抑菌活性的最佳方案。关键词：蜂蜜；抑菌活性；检测方法；比较；ThecomparativestudyontestmethodofantimicrobialactivityofhoneyAbstract:Thetestwastogetthebesttestmethodofantimicrobialactivityofhoneybycomparingthetest’spraticalexperienceandresult.Thatwaywouldplayakeyroleinchosingtestmethodofantimicrobialactivityofhoneyinfuture.Thetestcomparedfourhoney、twomakingmethodoftestplate、threetestbacteria、fiveconcentrationsandthreedetectionmethodofbacteriostasisactivityincludingK-Bmethod,punchmethodandoxfordcupmethod.Finallytheresultsshowthatacaciahoneyhaveantimicrobialactivity.Usingpreloadingbacterialiquidpoured-platemethodtomaketestplate、inoculatingEscherichiacoliwhosecolonyquantityisabout1×102CFU/ML、usingK-Bmethodtodoqualitativetest,andthebesttestscheme、andusingpunchmethodtodoquantitativetestisthebesttestschemeofantimicrobialactivityofhoney.Keywords:honey;antimicrobialactivity;testmethod;comparation1前言1.1选题背景1.1.1蜂蜜功能蜂蜜是蜜蜂从植物的花中采得的花蜜在蜂巢中酿制的蜜，14 是人类传统而古老的天然食品和医疗药品,食用和药用历史悠久。蜂蜜营养丰富、功能强大：蜂蜜中含有丰富的碳水化合物、蛋白质以及少量却优质的维生素、多酚类物质和矿物质，老少皆宜。蜂蜜功能多样，例如蜂蜜具有良好的抑菌活性及抗氧化能力，还可以润肠通便、促进酒精分解[1]。其中抑菌活性是指某些物质所具有的抑制或杀灭病原微生物的能力。在古代，蜂蜜的抑菌功效早就得以验证，如蜂蜜是世界上唯一不会腐败的天然食品；又如4500年前人类就将蜂蜜的抑菌活性应用于伤口治疗，从轻微皮肤感染到刀剑导致的严重割伤，蜂蜜不仅能促进伤口愈合，而且还能减轻伤者的疼痛[2]；又如明代医学家李时珍在《本草纲目》中对蜂蜜的记载为:蜂蜜主要用于治疗心腹邪气和各种痢疾，弥补五脏计等的不足，增加并补足气，止痛解毒，医除各种疾病，调和多种药，长期服用可以强身健体，不容易饥饿，也不容易衰老，延年益寿，其入药的功效有五个:清热,补中气,解毒,润燥,和止痛[3]。近年,国内外的许多学者也已经通过各种试验论证证实了蜂蜜强大的抑菌功能。如通过临床指证，蜂蜜在治疗皮肤烧伤或溃烂方面效果显著；又如麦卢卡蜂蜜（Manukahoney）被证实因其具有独特的抑菌活性物质—独麦素，而具有优越的抑菌活性，备受广大消费者的喜爱，是世界上迄今为止发现的两种医疗级蜂蜜之一，被称为新西兰的“国宝”[4]。1.1.2蜂蜜产业现状另一方面，麦卢卡蜂蜜抗菌活性的研究及其开发利用的成功非常值得我们借鉴，我国养蜂已有2000多年历史，是蜂蜜生产大国、消费大国及出口大国。我国地域广阔、蜜源丰富、人口众多，随着人民生活水平的提高，蜂蜜国内消费市场巨大。同时，我国也是世界上第一蜂蜜出口大国，中国蜂蜜占世界蜂蜜总产量四分之一以上。然而中国虽为蜂蜜大国，但同时也存在许多问题，假蜜盛行、蜂产品价格严重低估是其中最大问题。不仅损坏了蜂农的实际利益，也降低了蜂蜜企业加工技术的投入，失掉市场优势，削弱了中国蜂产品的市场竞争力[5-6]。当前虽然我国国家质检总局和国家标准委于2011年批准发布了GB14963-2011《食品安全国家标准--蜂蜜》国家标准，要求企业必须无条件执行，但是仍有很多不良企业用糖浆、甜味素、食用果胶等调制出来的成本只有几块钱的假蜂蜜不仅能够顺利通过国家的标准检测，而且比真蜂蜜更甜更粘稠，以“低价竞争”的方式打乱市场。因此国内市场假蜂蜜依旧盛行[7]。消费者没有实用的标准作为参考，仅凭观察、品尝，来鉴别蜂蜜的真假、质量的好坏是相当难的。由于假蜜泛滥所导致的消费者对蜂蜜产品的不信任，国内的蜂蜜市场情况不容乐观，但事实上蜂蜜产品其实有着稳定的消费需求和巨大的市场容量，仍然有巨大的消费空间尚待开发[8]14 。因此研究如何辨别蜂蜜的真假和好坏对于我国蜂产品消费市场的开发十分重要，而且研究蜂蜜独特的抑菌活性是现如今最认可的辨别蜂蜜的真假和好坏的方向。1.1.3蜂蜜研究现状迄今为止蜂蜜的抑菌活性机理的研究有了一定的进展,影响蜂蜜抑菌活性的因素主要有两个方面:一是蜂蜜的物理特性：如蜂蜜的高渗透压和低酸碱度对大多数菌而言，均不适合其生长。二是蜂蜜中所含有的抗菌成分；抗菌成分主要可以划分为过氧化氢类和非过氧化氢类，过氧化氢类通过氧化作用抗菌,非过氧化氢如溶菌酶、苯酚类化合物和黄酮类化合物，可以分别通过各种不同的途径抗菌[9]。然而至今为止，蜂蜜的抑菌机制仍然有许多不明白的地方需要进一步研究。目前，国际上围绕蜂蜜抑菌机制的研究越来越多。因为抑菌试验几乎是研究蜂蜜抑菌机制的必经步骤，因此蜂蜜抑菌试验方法选择的研究十分重要。抑菌试验是指在体外通过试验测定样品抑菌能力的一种试验。抑菌试验中最常用的方法是抑菌圈法，抑菌圈法又叫扩散法，是利用待测样品在培养基中扩散使其附近的细菌成长受到抑制而形成一个透明圈，即抑菌圈，根据所形成的抑菌圈大小来判定待测药物抑菌效果的一种方法。抑菌圈法不仅操作简单、试验成本低、而且成效好，高精度，因此被普遍使用。目前抑菌圈研究法中使用最多的主要有K-B法（Kirby-Bauertest）、牛津杯法和打孔法三种。K-B法即滤纸片法，选用质地均匀的滤纸，灭菌后烘干，浸入待测样品中，然后放置于平板培养基中培养16~24h后测定抑菌圈大小的一种方法。牛津杯法又称杯碟法，选用一定大小的牛津杯，灭菌后烘干，放置于试验平板中，然后往牛津杯中注入一定量的待测样品，培养16~24h后测定抑菌圈大小的一种方法。打孔法又称平板打孔法，是指选用一定孔径大小的打孔器，灭菌后烘干，然后在培养基上打孔，往孔中注入一定量的待测样品，培养16~24h后测定抑菌圈大小的一种抑菌活性检测方法[10-11]。1.2研究目的正因为抑菌试验方法多，研究蜂蜜抗菌机制时，抑菌活性检测方法的选择是一个比较麻烦的问题，因此本试验就是以获得蜂蜜抑菌活性最佳检测方法为研究目的的。1.3研究方法本次试验通过比较荆条花蜜、长白山椴树蜜、五倍子蜜、洋槐蜜四种供试蜂蜜，预加菌液倾注平板法、涂平平板法两种试验平板制做方法，大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌这三种供试菌，以十倍比稀释成五个浓度梯度的待测菌液，以及K-B法、牛津杯法和打孔法3种抑菌活性检测方法，获得蜂蜜抑菌活性最佳检测方法.14 1.4研究意义本试验以期为同行在进行蜂蜜抑菌活性研究选择方法时提供参考。首先有利于通过蜂蜜抑菌效果强弱的比较，对蜂蜜质量进行分级，为蜂蜜质量划分标准。其次对于未来蜂蜜抗菌机制的进一步研究十分有用，有利于促进新兴蜂蜜保健品的开发，让蜂蜜的商业价值得以更好的发掘和利用。如利用其抗菌、促进伤口愈合、减轻伤者疼痛的作用，可以更加充分地利用其在外科创伤治疗方面的价值，或者将其直接应用到抗炎抗菌药物地开发中，开发针对治疗耐药菌的药物[12]。目前抑菌试验研究比较多的有天然活性物质、中药材提取物和抗生素类等物质，其抑菌性能在药品、功能食品、保健品和化妆品等行业都是一个重要指标。抑菌活性对于蜂蜜来说因此也是一个相当重要的指标。抑菌活性好的蜂蜜不但具有作为天然的药品、保健品的应用价值，而且还可以作为抗菌新药源具有更大的开发空间，来解决现如今抗生素的大量使用带来了细菌的抗药性这一时代问题。然而目前文献中对于蜂蜜的抑菌机制研究较多，对于蜂蜜抑菌活性检测方法的研究较少，事实上找到一种最方便快捷准确的抑菌活性检测方法，对于日后蜂蜜抑菌机制的进一步研究是十分有益的，将为日后蜂蜜抑菌试验省时省力。2材料与方法2.1试验材料2.1.1　供试菌种由14教311试验室提供的大肠杆菌（E.coli）、金黄色葡萄球菌(S.aureus)和枯草芽孢杆菌(B.subtilis)。2.1.2　供试蜂蜜本试验所使用的蜂蜜皆是由张家界供销云商股份有限公司提供的、经过加工炼制过的熟蜜。包括：荆条花蜜、长白山椴树蜜、五倍子蜜、洋槐蜜。精确称取待测蜂蜜10g加入到50mL蒸馏水倍比稀释至0.2g/mL的浓度。冰箱保存备用。2.1.3　主要仪器、器皿及用品灭菌锅LMQ.J3870C北京市永光明仪器厂电子天平XY200JC常州市幸运电子设备有限公司电磁炉DF-ES012型深圳市联创实业有限公司生化培养箱SPL-250天津市莱玻特瑞仪器设备有限公司恒温培养振荡器ZHWY-C2102上海智城分析仪器制造有限公司冰箱（14教311试验室提供）无菌操作台（14教311试验室提供）14 培养皿（直径90mm）、烧杯（50mL）、移液管（1mL）、三角瓶（250mL）、试管（10mL）、打孔器（孔径6mm）、牛津杯（内径6mm）、新华3号滤纸、涂布棒、酒精灯、马克笔、接种环、试管架、pH试纸。2.1.4　培养基液体培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl10g/L，校正pH至7.8左右，121℃灭菌20min。平板培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl10g/L，琼脂粉20g/L，。将琼脂以外的各成分溶解于蒸馏水中，加入15%氢氧化钠溶液约2mL，校正pH至7.8左右，加入琼脂，加热煮沸，使琼脂融化，分装于三角瓶中，121℃灭菌20min。2.2　方法2.2.1　菌种的活化及菌液的制备分别挑取供试菌的单菌落接种至100mL液体培养基，分别分装于三角瓶中，37℃、200r/min摇床培养过夜，菌液备用。将菌液按照十倍进行梯度稀释，将三种供试菌分为三个组，每组取无菌试管5支,每支加液体培养基9.0mL,第1管加入活化好的供试菌菌液1.0mL,混合后吸取1.0mL加入第2管,同法稀释至第5管。2.2.2　试验平板的制备涂布平板法：先往已灭菌的平板中倾注20mL左右平板培养基，水平静置凝固，接种0.1mL菌液，涂布均匀后备用。预加菌液倾注平板法：往已冷却至50℃左右的平板培养基中注入1mL的菌液，混合均匀，倾注平板20mL/平板，水平静置凝固后备用。2.2.3　抑菌试验K-B法：圆滤纸片经灭菌后烘干，浸泡于浓度为0.2g/mL的待测蜂蜜液中0.5h，然后置于接种有供试菌的试验平板中，置35℃温箱培养16～18h，观察抑菌效果。牛津杯法：将已灭菌的牛津杯置于接种有供试菌的试验平板中,往杯中注入0.1mL浓度为0.2g/mL的待测蜂蜜药液,置35℃温箱培养16～18h，观察抑菌效果。打孔法：用已灭菌的打孔器在接种有供试菌的试验平板上打孔,小心挑去培养基小块以做成圆孔，往孔中注入0.1mL浓度为0.2g/mL的待测蜂蜜药液,置35℃温箱培养16～18h，观察抑菌效果。14 2.3试验方案2.3.1蜂蜜蜜源对蜂蜜抑菌活性的影响研究将金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌三种菌的五个浓度梯度的菌体稀释液接种到直径为9cm的无菌培养皿中，同样浓度的同种供试菌各接种4个试验平板，分为四组试验平板，暂用涂布平板法制作试验平板。待琼脂凝固后，用k-B法进行抑菌试验（所有操作均在无菌工作台上进行），4组试验平板分别用荆条花蜂蜜、长白山椴树蜜、五倍子蜂蜜、洋槐蜂蜜抑菌。通过比较培养皿中有无抑菌现象出现，获得对供试菌有抑菌活性的蜂蜜品种。2.3.2试验平板制作方法的比较研究将金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌三种菌的五个浓度梯度的菌体稀释液接种到直径为9cm的无菌培养皿中，同样浓度的同种供试菌各接种2个试验平板，同样浓度的同种供试菌的试验平板用同一种方法制作，共两种方法：分别为预加菌液倾注平板法和涂布平板法。待琼脂凝固后，用k-B法进行抑菌试验，所有操作均在无菌工作台上进行。通过比较培养皿中细菌生长、分布情况，获得最适试验平板制作方法。2.3.3试验最适菌及其最适浓度研究因为当抑菌剂含量一定时，抑菌圈的大小跟菌种类及其菌体浓度有很大关系，如果该菌适应该抑菌剂所造成的环境，或者说如果该菌菌体浓度过大，会拮抗抑菌剂的作用，导致抑菌圈偏小，不易观察。因此，研究试验平板中的抑菌圈大小，以确定最适合的活菌浓度做蜂蜜的抑菌试验，更利于抑菌效果的观察。用上一步骤所得到的试验结果制作试验平板，将金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌三种菌的五个浓度梯度的菌体稀释液接种到直径为9cm的无菌培养皿中，同样浓度的同种供试菌各接种3个试验平板，待琼脂凝固后，用k-B法进行抑菌试验，三个试验平板中至少两个出现抑菌现象，则证明蜂蜜对该浓度的该菌有抑菌效果。通过比较各个培养皿中的抑菌效果，细菌生长、分布情况，获得三种供试菌5种浓度中，蜂蜜抑菌试验最适菌及其最适浓度。2.3.4蜂蜜抑菌活性检测方法比较根据上述两个步骤试验结果，将金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌三种菌的五个浓度梯度的菌体稀释液接种到直径为9cm的无菌培养皿中，将上述步骤所得出的最佳菌液浓度的最适菌共接种9个试验平板，待琼脂凝固后，分别采用K-B法、牛津杯法、打孔法三种不同的抑菌效果检测方法进行抑菌试验，每种方法作3个平行样本，分别比较它们的优缺点，以期获得最佳的蜂蜜抑菌活性检测方法。14 所有操作均在无菌工作台上进行，通过比较培养皿中抑菌效果及其变化趋势，细菌生长、分布情况，获得最佳蜂蜜抑菌活性检测方法。3结果与分析3.1蜂蜜蜜源对蜂蜜抑菌活性的影响蜂蜜蜜源对蜂蜜抑菌活性的影响结果如表1所示：表1蜂蜜蜜源对蜂蜜抑菌活性的影响Tab.1Effectofhoneysourceonantibacterialactivityofhoney荆条花蜜五倍子蜜椴树蜜洋槐蜜抑菌现象无无无有如表1所示：试验时，荆条花蜜，五倍子蜜，椴树蜜在接种有供试菌的试验平板上均没有抑菌现象出现，即无抑菌效果，说明这些蜂蜜对这些供试菌均没有抑菌活性，而加有洋槐蜜的试验平板上有抑菌现象的出现，说明洋槐蜜对这些供试菌有抑菌活性。根据Allen对新西兰26种蜜源的345个样品的研究结果可知:不同蜜源的蜂蜜抑菌活性相差很大[13]，这是因为蜂蜜中目前已经得到确认的主要抗菌活性成分有过氧化氢。蜂蜜中存在过氧化氢酶(Catalase)能分解过氧化氢,对过氧化氢的抗菌作用起一定的抑制作用，过氧化氢酶含量越高，蜂蜜中过氧化氢的含量就越低，蜂蜜的抑菌效果就越差，而且过氧化氢酶主要来自花粉,极少部分来自花蜜。蜂蜜中还有很多非过氧化氢类物质具有很强的抑菌活性，它们主要包括黄酮类化合物、萜类、苯酚类以及有机酸中的苯甲酸和脱落酸等。蜂蜜中黄酮类化合物因蜜源植物不同而种类不同,因此蜜源植物不同的蜂蜜抑菌活性也不同[14]。根据以上的结果与分析，后续试验均采用抑菌活性好的洋槐蜜进行。3.2试验平板制作方法比较试验平板制作方法比较结果如下图1和下表2所示：14 (a)预加菌液倾注平板法(b)涂布平板法(a)Preloadingbacterialiquidpoured-platemethod(b)Spreadplatemethod图1试验平板制备方法比较结果Fig.1Resultoncomparisonofmanufacturemethodoftestplate表2试验平板制备比较Tab2Comparisononmanufacturemethodoftestplate涂布平板法预加菌液倾注平板法优点操作简单，所用菌液少，抑菌现象明显抑菌现象明显，菌体生长均匀，重复性好，效果好缺点菌体生长不够均匀，重复性较差，效果一般所用菌液多，需要把握好倾注平板培养基时培养基的温度根据图1和表2可以得知,预加菌液倾注平板法相比较于涂布平板法更适合蜂蜜的抑菌试验，因为能更好的观察抑菌现象，因此，后续试验将均采用预加菌液倾注平板法制备试验平板。3.3试验平板中最适菌及其最适浓度试验结果试验平板中最适菌及其最适浓度试验结果如下表3及图2~4所示：表3供试菌抑菌效果的比较Tab.3Comparisononantibacterialeffectoftestorganism菌落数量级（CFU/mL）抑菌现象金黄色葡萄球菌大肠杆菌枯草芽孢杆菌1×102++++++---1×103++-+++---续表3菌落数量级（CFU/mL）抑菌现象金黄色葡萄球菌大肠杆菌枯草芽孢杆菌1×104---+-----1×105---------1×106---------14 注：+++：三个试验平板均有有抑菌效果；++-：两个试验平板有抑菌效果；+--：一个试验平板有抑菌效果；---：三个试验平板均没有抑菌效果（a）1×102CFU/mL（b）1×103CFU/mL（c）1×104CFU/mL（d）1×106CFU/mL（e）1×106CFU/mL图2不同浓度金黄色葡萄球菌抑菌效果的比较Fig.2ComparisononantibacterialeffectofdifferentconcentrationStaphylococcusaureus（a）1×102CFU/mL（b）1×103CFU/mL（c）1×104CFU/mL14 （d）1×105CFU/mL（e）1×106CFU/mL图3不同浓度大肠杆菌抑菌效果的比较Fig.3ComparisononantibacterialeffectofdifferentconcentrationEscherichiacoli（a）1×102CFU/mL（b）1×102CFU/mL（c）1×104CFU/mL（d）1×106CFU/mL（e）1×106CFU/mL图4不同浓度枯草芽孢杆菌抑菌效果的比较Fig.4ComparisononantibacterialeffectofdifferentconcentrationBacillussubtilis由表3可知，接种有枯草芽孢杆菌的试验平板上无抑菌现象出现，由此说明洋槐蜜对枯草芽孢杆菌不具有抑菌活性，首先可排除枯草芽孢杆菌进行后续试验。接种有金黄色葡萄球菌的试验平板在菌落数量级为1×102CFU/mL时，三个试验平板均有抑菌现象出现，在菌落数量级为1×103CFU/m时，有二个试验平板出现抑菌现象：接种有大肠杆菌的试验平板在菌落数量级为1×102CFU/mL和1×103CFU/m时，三个试验平板均有抑菌现象出现，在菌落数量级为1×104CFU/m时，也有一个试验平板出现抑菌现象，所以说，洋槐蜜对大肠杆菌的抑菌活性强于对金黄色葡萄球菌的。而且14 由图2~4可见金黄色葡萄球菌菌落小、呈圆形、边缘整齐、金黄色、不透明、分布较不均匀；而大肠杆菌菌落较大、边缘光滑、湿润、透明、偏米白色、菌落大小和分布均更加均匀，更容易观察抑菌效果，由此可初步认为大肠杆菌更适合蜂蜜的抑菌试验。因此，根据以上的试验结果和分析，后续的蜂蜜抑菌试验将采用菌落数量级为1×102CFU/ml的大肠杆菌试验平板进行。3.4蜂蜜抑菌活性检测方法比较结果本试验的蜂蜜抑菌活性检测方法有这3种：K-B法、牛津杯法和打孔法。参考前人的方法进行试验，比较这3种方法的优缺点，结果如下图5和图6所示。（a）K-B法(b)牛津杯法(c)打孔法图5蜂蜜抑菌活性检测方法比较结果Fig.5Thecomparativeresultontestmethodofantimicrobialactivityofhoney图6蜂蜜溶液在培养基上的扩散示意图[11]Fig.6Diffusionschematicdiagramofhoneysolutiononculturemedium[11]从图5可知，3种抑菌活性检测方法各有优缺点：K-B法的优点是其操作简单方便、重复性高、抑菌效果明显；缺点是由于浸泡药品时很难控制药品在滤纸片上的吸附量且重复性较差、抑菌范围小，因此很适合用于判断蜂蜜是否有抑菌活性，而不适合于判断蜂蜜抑菌活性的强弱。对于牛津杯法，其是国内外测定抗生素效价的通用方法[15]。其优点是通过试验，抑菌效果好；14 其不足是放置牛津杯时，很难保证每个牛津杯与试验平板的接触情况，而且加完样品转移至培养箱的过程当中，由于试验人员的不小心或其它原因很容易会使牛津杯移动或松动甚至倒翻，对试验结果极易造成影响，所以实际操作困难，获得的抑菌效果的重复性较差，质量也较差。最后对于打孔法，其优点是操作简单方便、抑菌效果好、而且在这3种方法当中，打孔法的误差是最小的，这可以从蜂蜜的扩散途径来解释，如图6所示：在K-B法和牛津杯法的试验平板中，蜂蜜溶液是从培养基表面向四周呈球形扩散，培养基越厚，培养基表面与底部的浓度差就越明显，造成表面和底部所形成的抑菌圈范围大小就相差越大，试验人员的观察就越容易产生误差；而在打孔法的试验平板中，蜂蜜溶液是从打孔处直接向四周的培养基均匀扩散的，所以培养基表面和底部的抑菌范围相差无几，避免了前两种方法中由于试验人员观察差异而导致结果误差。因此相比较于K-B法更适合于定量试验，用于判断抑菌活性的强弱，受试验人员的青睐；但是值得注意的是打孔完后，需要挑去孔中培养基小块的时候，务必要小心谨慎地操作，如果用力不当，很容易破坏掉孔的完整性，导致抑菌范围形状不规则，不易观察抑菌效果。根据以上的试验结果和分析，在蜂蜜抑菌活性检测方法中：K-B法最适合于定性试验：适合于判断待测蜂蜜是否有抑菌活性。打孔法最适合于定量试验：适合于比较有抑菌活性的蜂蜜抑菌活性的强弱。4结论本试验比较了四种蜜源不同的蜂蜜之间抑菌活性的强弱，有荆条花蜜、长白山椴树蜜、五倍子蜜、洋槐蜜，结果表明只有成熟度更高的洋槐蜜抑菌活性最强，适用于本试验。又比较了预加菌液倾注平板法和涂布平板法这两种制备试验平板的方法，结果表明：预加菌液倾注平板法所制备的试验平板上的菌落分布更为均匀，重复性好，因此更适合于本试验采用。然后又比较了三种供试菌（金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌）分别按十倍比稀释成相同的5个浓度梯度时菌落的生长和分布情况，结果表明：大肠杆菌在菌落数量级为1×102CFU/mL时菌落大小平均，分布均匀，疏密得当，抑菌效果明显，更适合于本试验。本试验最后比较了三种蜂蜜抑菌活性的检测方法：K-B法、牛津杯法和打孔法，最终得出：K-B法最适合于定性试验，适合于判断待测蜂蜜是否有抑菌活性；打孔法最适合于定量试验，适合于比较有抑菌活性的蜂蜜抑菌活性的强弱。本试验最终得出：检测蜂蜜抑菌活性时，我们可以采用预加菌液倾注平板法制作试验平板，接种菌落数量级约1×102CFU/mL的大肠杆菌，采用K-B法检测蜂蜜抑菌活性有无，再用打孔法检测蜂蜜抑菌活性强弱。本试验唯一的遗憾是没有出现明显的抑菌圈，这可能是蜂蜜待测液浓度过低所致。14 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